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目的:癫痫是一种复杂的反复无端发作的临床综合征,由多种原因造成脑部神经元高度同步化异常放电引起,分为特发性癫痫综合征、症状性癫痫综合征与可能的症状性癫痫综合征。特发性癫痫综合征,又称原发性癫痫、遗传性癫痫,多见于儿童及青少年,绝大多数患者在30岁前发病,没有其他大脑结构性损伤和其他神经系统症状与体征。到目前为止,癫痫的发病机制仍不清楚。震颤（Tremor,TRM）大鼠是京都大学大鼠种群中发现的基因突变大鼠,其由Wistar大鼠一对常染色体发生隐性基因突变而来,在2周龄即出现癫痫样症状,其发病机制及治疗与人类情况相似,对癫痫药物反应良好,由此作为本课题组理想的研究遗传性癫痫的动物实验模型。神经肽Y（Neuropeptide Y,NPY）是一种广泛分布于中枢及外周神经系统并维持内环境稳态的多肽,由36个氨基酸残基组成。NPY在机体多种生理活动中发挥着重要功能,包括调节骨稳态、血压、能量等。在中枢,NPY抑制交感兴奋、抗焦虑、促进食欲;在外周,NPY诱导血管收缩、血管平滑肌增殖。到目前为止,NPY在部分癫痫模型中的作用已经证实,但是其在遗传性癫痫特别是癫痫TRM大鼠中的作用及机制仍不清楚。本研究中,我们以TRM大鼠为遗传性癫痫模型,以Wistar大鼠为对照模型,通过实验分组,采用侧脑室NPY或溶剂注射的方式,通过脑电图记录、Morris水迷宫及分子生物学等技术研究脑电图变化、学习记忆能力、细胞存活率、凋亡指标、NPY受体的表达以及Ca M/Ca MKII通路,旨为阐明神经肽Y在遗传性癫痫的保护作用及其机制,为癫痫的发病机理提供理论基础和实验依据。研究方法:1.动物分组和NPY处理将9-12周龄的TRM大鼠和Wistar大鼠按不同的实验设计随机分为NPY组和溶剂组。使用溶解在无菌生理盐水中的NPY,对大鼠进行侧脑室（intracerebroventricular）注射。使用水合氯醛麻醉大鼠,并固定在立体定向仪上。所用NPY剂量为2μg/2μL,三天后进行后续实验。2.脑电图记录和分析为进行脑电图记录,使用绝缘材料包裹的金属电极长期植入右侧海马（中线旁2.0mm,前囱后4mm,皮质表层下3.0mm）（n=4）。微螺钉作为参比电极和接地电极分别固定在额骨和枕骨上。记录过程中,动物保持清醒状态,分析30min内大鼠癫痫性放电的次数和总持续时间。3.水迷宫用改良的水迷宫测试大鼠认知学习的能力（n=6）。将充满温水（22°C±2°C）的圆形游泳池划分成四个相等的象限,分别用I-II-III-IV标记,一个水下平台被放置在象限III的中心。用在目标象限的总时间来评价认知学习的能力。所有行为参数通过泳池中心上方的固定摄像机记录,并连接到计算机跟踪系统。4.组织学研究解剖大鼠脑组织（n=3）,进行组织学实验。多聚甲醛固定,石蜡包埋,从前囟后面切割100张连续冠状脑片,进行Nissl染色。中性树胶封片,使用光学显微镜观察并照相,对尼氏染色阳性神经元进行计数,分析各组大鼠CA1、CA3区神经元是否丢失及数量差异。5.免疫印迹（Western Blot）实验法麻醉大鼠（n=3）,断头取脑,提取海马总蛋白。使用配有蛋白酶抑制剂的组织裂解缓冲液匀浆样品,低温离心,取上清液,BCA试剂盒检测样品总蛋白浓度。混匀样品上清液和蛋白样品缓冲液,进行SDS-PAGE电泳,使用聚氟乙烯（PVDF）膜进行转膜,BSA封闭,一抗孵育过夜。TBST漂洗,二抗孵育。ECL发光液显影,Image J软件分析各条带。6.统计分析所有的数据均以平均数±标准误表示。采用t检验（Student’s t-test）或单因素方差分析（one-way ANOVA）,之后进行事后Tukey检验（posthoc Tukey’s test）来评价不同组之间的差异。结果:1.NPY对癫痫TRM大鼠放电作用的影响应用脑电图记录检测发现TRM大鼠海马表现出典型的100μV-800μV癫痫样放电,与本模型的原始报告基本一致。注射NPY后,TRM大鼠30min内癫痫样放电的次数与癫痫样放电总持续时间均显著降低。2.NPY对癫痫TRM大鼠认知能力的影响应用Morris水迷宫来评价TRM大鼠的认知能力与外源性NPY的作用,分别分析逃避潜伏期（s）、路径长度（cm）、游泳速度（cm/s）和目标象限的时间占比（%）。NPY缩短TRM大鼠的逃逸潜伏期和路径长度,不同处理组之间的游泳速度没有变化。与TRM+Vehicle组相比,TRM+NPY组大鼠在目标象限停留的时间增加。我们的数据显示侧脑室注射NPY后,TRM大鼠的空间学习和记忆能力得到提升。3.NPY对癫痫TRM大鼠海马神经元存活率的影响对TRM、Wistar大鼠进行侧脑室外源性NPY或生理盐水注射后,进行脑切片Nissl染色,计数后发现CA1区与CA3区:与Wistar+Vehicle组相比,TRM+Vehicle组完整神经元数量无统计学差异;与TRM+Vehicle组相比,TRM+NPY组完整神经元数量无统计学差异。因此NPY对TRM大鼠海马CA1、CA3区神经元存活率无影响。4.NPY对癫痫TRM大鼠凋亡指标的影响Western Blot实验结果表明:与Wistar+Vehicle组相比,TRM+Vehicle组凋亡标志物（包括Caspase-3、Pro-caspase-3和Bcl-2/Bax）的表达无统计学差异;与TRM+Vehicle组相比,TRM+NPY组凋亡标志物的表达无统计学差异。因此NPY对TRM大鼠海马神经元的凋亡无影响。5.NPY对癫痫TRM大鼠NPY受体的影响Western Blot实验结果表明:与Wistar+Vehicle组相比,TRM+Vehicle组NPY1R表达降低;与TRM+Vehicle组相比,TRM+NPY组NPY1R表达增加。与Wistar+Vehicle组相比,TRM+Vehicle组NPY2R表达增加;与TRM+Vehicle组相比,TRM+NPY组NPY2R表达无统计学差异。6.NPY对癫痫TRM大鼠Ca M/Ca MKII通路的作用。通过Western Blot实验对p-Ca MKII、Ca MKII与Ca M进行蛋白表达分析,结果表明:与Wistar+Vehicle组相比,TRM+Vehicle组p-Ca MKII表达降低;与TRM+Vehicle组相比,TRM+NPY组p-Ca MKII表达增加。与Wistar+Vehicle组相比,TRM+Vehicle组Ca MKII表达无统计学差异;与TRM+Vehicle组相比,TRM+NPY组Ca MKII表达无统计学差异。与Wistar+Vehicle组相比,TRM+Vehicle组Ca M表达增加;与TRM+Vehicle组相比,TRM+NPY组Ca M表达降低。结论:NPY在癫痫中具有神经保护作用,但其在遗传性癫痫中的作用及其机制尚不清楚。我们研究发现:1.与正常Wistar大鼠相比,癫痫TRM大鼠脑电图显示出振幅达100μV-800μV的癫痫样波;NPY改善癫痫TRM大鼠的神经元放电,减少癫痫样放电的次数与癫痫样放电的持续时间。2.NPY改善癫痫TRM大鼠的认知能力,增强其空间学习记忆能力。3.NPY对TRM大鼠海马CA1、CA3区神经元存活率无影响,无明显抑制神经元丢失的作用。4.NPY对TRM大鼠海马神经元凋亡指标无影响。5.NPY促进TRM大鼠NPY1R的表达,对TRM大鼠NPY2R的表达无影响。6.NPY对TRM大鼠的Ca M的表达水平有减弱作用,对p-Ca MKII表达水平有增强作用。我们首次发现NPY治疗在TRM大鼠中具有抗癫痫作用,包括减轻癫痫放电和空间认知障碍。Ca M/Ca MKII通路可能参与这一过程。我们的结果初步表明NPY可能是一种新型遗传癫痫治疗方法。