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第一部分IL-37对Apo E–/–小鼠动脉粥样硬化进展的作用目的:目前IL-37被认为是一种能够下调多种促炎因子的抗炎物质,参与多种慢性疾病的发生发展。动脉粥样硬化是最常见的慢性疾病之一,但其缺乏有效的预防及治疗手段。本研究目的在于探究IL-37对动脉粥样硬化进展的保护作用,及其在动脉粥样硬化疾病进展中的免疫调控作用,寻找动脉粥样硬化潜在的新治疗靶点。方法:我们将实验组分为Apo E–/–及IL-37tg Apo E–/–小鼠两组,每组各约15～20只。在8周大小时开始进行西方饮食饲养,12周后处死小鼠,称量并记录体重。收取小鼠后,我们提取血液并分离出血清,检测总胆固醇、甘油三酯和葡萄糖,并通过ELISA检测了血清中多种炎症因子水平,Th1相关的细胞因子,如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12β和IFN-α,Th2相关细胞因子,如IL-4和IL-10。而后剥离整根主动脉并包埋心脏进行主动脉瓣环斑块切片,对斑块进行Oil Red O油红染色,分析斑块大小。为了进一步评估IL-37对动脉粥样硬化斑块的免疫调节,我们对两组小鼠主动脉瓣环处的斑块进行了CD4、CD68、CD31和α-SMA的免疫组化染色。结果:首先,我们构建的IL-37tg小鼠使得IL-37在小鼠体内稳定表达。IL-37对小鼠的体重、胆固醇、甘油三酯和葡萄糖无显著影响。相较于普通Apo E–/–小鼠,IL-37tg Apo E–/–小鼠主动脉斑块总面积和主动脉根部斑块面积均显著减小。且IL-37改变了Apo E–/–小鼠血清中多种炎症因子的表达水平,其中包括一些与Th1相关的细胞因子在IL-37tg Apo E–/–小鼠外周血中明显减少,Th2相关的细胞因子在IL-37tg Apo E–/–组小鼠外周血中明显升高。进一步对主动脉根部斑块进行免疫组化染色发现,IL-37tg Apo E–/–组的CD4阳性T淋巴细胞减少,CD68阳性巨噬细胞下降,内皮细胞无显著变化,平滑肌细胞增多。结论:IL-37能够显著减轻动脉粥样硬化的疾病进展,抑制全身Th1相关细胞因子水平,促进Th2相关细胞因子分泌水平,减少斑块中CD4阳性T细胞、巨噬细胞的浸润。第二部分IL-37对斑块内浸润的树突状细胞的的调控研究目的:目前IL-37及其前体被证实由多种免疫及非免疫细胞产生和分泌,树突状细胞便是其重要来源之一。成熟的树突状细胞能够促进动脉粥样硬化的进展。本研究的目的便在于探究IL-37对树突状细胞的调控作用,以及对动脉粥样硬化疾病进展的影响。方法:在喂食西方饮食12周后,我们收取Apo E–/–小鼠和IL-37tg Apo E–/–小鼠的心脏,并进行了主动脉根部主动脉瓣环的切片。为了检测斑块内树突状细胞的浸润位置及浸润数量,我们对瓣环处斑块进行了CD11c的染色。此外,我们取两组小鼠的脾脏细胞进行了流式细胞术检测,以测试小鼠脾脏中树突状细胞CD86和MHCII表达水平。随后,我们培养了骨髓分离并诱导分化的树突状细胞,以在体外进一步测试IL-37对树突状细胞的影响。在预先用100 ng/m L的IL-37进行预处理后,我们用ox LDL对树突状细胞进行了刺激。24小时后,我们用流式细胞术和RT-PCR检测了MHCII和CD86的表达情况。同时,我们还用RT-PCR检测了DCs中细胞因子的表达水平。为了进一步探索IL-37的这种抗炎特性,我们用不同浓度的IL-37对树突状细胞进行了处理,并检测了CD80、CD86及Th细胞相关细胞因子的m RNA水平。此外,我们用ELISA检测了IL-37在IL-37tg小鼠和IL-37tg Apo E–/–小鼠的血清水平。结果:CD11c阳性的树突状细胞主要浸润于斑块表面更靠近管腔的位置。与Apo E–/–小鼠相比,IL-37tg Apo E–/–小鼠斑块中CD11c阳性树突状细胞显著减少。此外,小鼠脾脏细胞流式分析结果显示IL-37tg过表达使脾脏中树突状细胞的成熟度降低。体外实验结果表明,10 ng/m L的IL-37可以最有效的抑制DCs的成熟以及Th1相关细胞因子的表达。在IL-37浓度低于100 ng/m L时,随着IL-37浓度的递增,IL-37的抗炎能力略有减弱。当用200 ng/m L IL-37预处理时,与使用100 ng/m L IL-37预处理的DCs相比,炎症细胞因子的m RNA水平并没有延先前的趋势变化,IL-1β、IL-6和IL-12β不再减少,IL-10不再增加。树突状细胞的成熟不再受到抑制。ELISA结果表明,IL-37在正常IL-37tg小鼠血清中含量较低,在动脉粥样硬化IL-37tg小鼠血清中明显升高,但低于150 ng/m L。结论:IL-37能够减少斑块内树突状细胞浸润数量并降低体内树突状细胞成熟度。体外低浓度IL-37处理能够抑制ox LDL诱导的树突状细胞成熟,但这个抑制作用呈非浓度依赖性。第三部分IL-37调控斑块内树突状细胞成熟的分子机制研究目的:IL-37已被证实能够通过与IL-1R8结合发挥其作用。在之前的研究中,我们发现IL-37能够抑制斑块内树突状细胞的成熟,但具体机制不明。此部分即旨在探究IL-37通过树突状细胞抑制动脉粥样硬化进展的具体分子机制。方法:首先,我们对Apo E–/–小鼠和IL-37tg Apo E–/–小鼠的斑块进行了IL-1R8、TLR4、p65免疫组化染色,并使用western blot检测了脾脏和胸腺中IL-1R8、TLR4和p65的蛋白质水平。另外,为了探究IL-1R8-TLR4-NF-κB通路是否存在于斑块浸润的DCs中,我们用CD11c分别和IL-1R8、TLR4和p65对细胞进行免疫荧光共染色。最后,为了探究体外不同浓度IL-37对树突状细胞IL-1R8、TLR4、NF-κB通路的影响,我们用不同浓度的IL-37对骨髓分离诱导的树突状细胞进行预处理,并检测了通路中各分子的水平变化。结果:斑块内免疫组化染色结果显示IL-37tg Apo E–/–组斑块中的IL-1R8表达升高,TLR4和p65明显减少,且IL-1R8主要表达于斑块表面靠近管腔的细胞中。脾脏western blot结果显示与WT小鼠相比,IL-1R8在Apo E–/–小鼠中略有增加,在IL-37tg Apo E–/–小鼠中明显增加;TLR4在Apo E–/–小鼠中显著升高,但在IL-37tg Apo E–/–小鼠中下降;NF-κB通路的p65变化与TLR4相似,不过差异较小。免疫荧光共染色结果显示IL-1R8、TLR4和p65在DCs中表达丰富。IL-37tg Apo E–/–小鼠斑块的DCs中IL-1R8表达增多,TLR4和p65的表达减少。体外实验结果显示当使用高浓度的IL-37预处理DCs时,虽然IL-1R8继续生成增多,但TLR4的表达并没有受到相应的抑制。结论:IL-37调控Apo E–/–小鼠斑块内及全身IL-1R8、TLR4、NF-κB的变化,这一分子通路的活化部分也解释了IL-37的非浓度依赖性现象。第四部分IL-1R8、TLR4是IL-37抑制树突状细胞成熟的重要分子通路目的:在此前的研究中,我们发现IL-1R8、TLR4与IL-37的调控密切相关,但IL-37是否通过IL-1R8和TLR4抑制树突状细胞成熟尚未能证明。本部分研究旨在探究IL-1R8和TLR4是否是IL-37抑制树突状细胞成熟的重要通路。方法:为了探究IL-1R8是否是IL-37发挥保护作用的关键分子,我们试图干扰IL-1R8,并监测IL-37的保护作用。首先,我们从IL-1R8–/–小鼠身上分离出骨髓细胞并诱导其分化为DCs,用100 ng/m L的IL-37对DCs进行了预处理,同前用ox LDL刺激后,用流式细胞术检测了DCs表面CD86和CD80的表达,并检测了BMDCs中TLR4和p65的m RNA水平。随后,我们培养了TLR4–/–小鼠来源的BMDCs,以确认TLR4对DCs成熟过程的影响。在使用50μg/m L ox LDL刺激后,我们用流式细胞术检测了TLR4–/–小鼠来源的BMDCs和C57小鼠来源的BMDCs中CD86和MHCII阳性细胞的比例。结果:结果显示,在用ox LDL刺激后,IL-37有效地降低了C57小鼠分离的BMDCs上MHCII和CD86的表达,而这些作用在IL-1R8–/–小鼠分离的BMDCs上并未观察到,说明IL-1R8在IL-37的抑制BMDCs成熟和抑制促炎因子的分泌的过程中起着不可或缺的作用。在IL-1R8–/–的BMDCs中,IL-37不再抑制IL-1β、IL-12β和IL-6的表达,且TLR4的表达显著升高,而p65和i KBε的m RNA水平略有上升。IL-1R8的存在能够抑制TLR4的表达,继而影响下游NFκB通路p65和i KBε的活性。TLR4–/–小鼠BMDCs中CD86和MHCII阳性细胞的比例明显减少。结论:IL-37通过IL-1R8-TLR4-NF-κB通路抑制树突状细胞的成熟,并显著缓解了Apo E–/–小鼠动脉粥样硬化的进展。