第一部分碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM高表达的研究目的外排泵系统是多重耐药铜绿假单胞菌的重要耐药机制之一。MexAB-OprM外排泵是铜绿假单胞菌中对碳青霉烯类抗生素耐药最主要的外排泵系统,mex R、nal C和nal D是MexAB-OprM外排泵的调控基因。本研究是为了解MexAB-OprM外排泵在碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,CRPA)中的表达情况,以及调控基因mex R,nal C和nal D的突变对外排泵基因mex A表达量的影响。方法筛选收集安徽医科大学第一附属医院2011年~2012年微生物室分离的碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌。采用微量肉汤稀释法检测筛选出的铜绿假单胞菌耐药株对亚胺培南和美罗培南的MIC(Minimal inhibitory concentration,最低抑菌浓度),并进行外排泵表型筛选试验。Carba NP试验和EDTA协同试验分别用来检测外排泵筛选阳性菌株是否产碳青霉烯酶和金属酶。采用Real-time PCR检测外排泵表型阳性的CRPA外排泵融合基因mex A的m RNA表达水平。同时利用普通PCR扩增外排泵阳性菌株的外排泵基因mex B和调控基因mex R,nal C,nal D以及外膜蛋白Opr D2基因,所得PCR产物进行测序并比对。结果75株CRPA菌株,有13株(17.3%)外排泵表型筛选试验阳性。这13株CRPA菌株的Carba NP试验和EDTA协同试验的结果均为阴性。PCR结果显示,13株外排泵表型阳性的铜绿假单胞菌中,有10株mex B基因阳性,且其外排泵调控基因mex R,nal C,nal D均为阳性。PCR产物测序比对结果显示,有9株CRPA的Nal C发生第71位氨基酸的点突变Gly→Glu,其中8株CRPA同时还发生第209为氨基酸的点突变Ser→Arg;仅有1株CRPA发生Nal D第158位氨基酸突变Thr→Ile。有8株CRPA发生Mex R的点突变。结论MexAB-OprM外排泵在碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌起着至关重要的作用。外排泵调控基因的点突变或许是导致外排泵MexAB-OprM高表达的原因之一。第二部分MexAB-OprM系统在铜绿假单胞菌亚胺培南耐药的作用研究目的铜绿假单胞菌是临床上重要的条件致病菌,由于其对碳青霉烯类抗生素的耐药性越来越高,因此对其耐药机制的研究越来越受到重视。MexAB-OprM是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药最主要的外排泵系统,特别是其对美罗培南耐药十分相关,但一直认为其对亚胺培南的耐药无作用。本研究针对一株外排泵抑制剂对亚胺培南有效而对美罗培南无效的铜绿假单胞菌,利用同源重组技术敲除外排泵MexAB-OprM的融合蛋白基因mex A,以研究外排泵MexAB-OprM对亚胺培南耐药的作用。方法利用细菌体内广泛存在RecBCD系统对外源进入的DNA进行同源重组,从而实现目标基因的等位替换。首先采用PCR扩增得到mex A基因的上、下游同源臂A、B片段,再用交叠PCR扩增得到mex A基因上下游同源臂的融合AB片段,此AB片段中间已缺失目标基因mex A。自杀载体p LP12为T线性化载体,可直接与纯化PCR产物连接,将目标基因的融合AB片段与自杀载体p LP12T连接。连接产物转化大肠杆菌DH5αλpir感受态细胞,经p LP-UF/p LP-UR筛选AB插入的克隆,挑取阳性克隆,提取质粒p LP12-mex A,转化大肠杆菌β2163。大肠杆菌β2163具有高效的接合效应,且其由于缺陷型,只能在含DAP(Diaminopimelic acid)的培养基中生长。将自杀载体连接产物p LP12-mex A通过接合输入到靶细菌中,培养后菌液涂布LB平板(Cm=200μg/ml)。由于自杀载体不能在细菌中复制,在抗生素选择(Cm)压力下,只有整合有自杀载体的插入突变株才可以存活(发生第一次同源重组)。挑取阳性克隆,涂布含L-阿拉伯糖的LB平板上,L-阿拉伯糖能诱导自杀载体毒性基因的表达,在第二轮反向选择压力下,只有细菌基因组发生第二次同源重组并丢失自杀质粒的细菌才可以存活。第二组同源重组后,子代细菌产生靶基因的缺失突变株和野生型菌株,通过PCR克隆筛选后将PCR产物直接测序,确认mex A缺失突变株的构建成功。将mex A基因敲除后的菌株进行Real-time PCR验证mex A的相对表达量,以及进行亚胺培南的药敏试验。结果分别以mex A上下游同源臂的引物PCR扩增得到上下游同源臂A、B片段,其片段长度分别为618bp、416bp。以A、B片段为模板,进行交叠PCR得到AB融合片段,长度为993bp。将AB融合片段与自杀载体p LP12T连接,用载体的引物进行PCR验证,筛选得到AB插入的克隆(p LP12-mex A),连接成功的载体片段的长度明显长于未连接成功的载体。将连接成功的质粒转化到供体菌大肠杆菌β2163,在其高接合效率下成功将质粒(p LP12-mex A)输入到原始的铜绿假单胞菌(野生型)中去。同时,由于细菌胞内重组酶的存在,接合的同时也在发生基因相似片段的同源重组。在抗生素选择(Cm)压力下,只有质粒插入到染色体指定位点的铜绿假单胞菌能存活,挑取阳性克隆并进行PCR验证,野生株只产生一个扩增片段,插入突变形成两个扩增条带。插入突变株进一步涂布于含L-阿拉伯糖的LB培养基上,由于L-阿拉伯糖能诱导反向选择标记基因的毒性作用,在第二轮反向选择压力下,只有细菌基因组发生第二次同源重组并丢失自杀质粒的细菌才可以存活,子代细菌产生靶基因的缺失突变株和野生型菌株。通过PCR筛选,缺失突变克隆扩增片段产生1403bp片段,野生型扩增片段长2159bp。将缺失突变克隆菌株纯化培养后再次扩增验证,PCR产物测序,确认mex A缺失突变株构建成功。mex A基因敲除后mex A相对表达量几乎下降至0(22.63→0.00014),该结果进一步证明了mex A基因被敲除。对mex A基因敲除前后菌株进行药敏试验,其敲除后铜绿假单胞菌对亚胺培南的MIC明显下降(32μg/ml→4μg/ml)。结论利用同源重组的技术原理,采用线性化自杀载体p LP12T成功的将铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM的mex A基因敲除。敲除后菌株对亚胺培南的耐药性明显下降,提示外排泵MexAB-OprM参与了亚胺培南耐药性的形成。第三部分利用RNA-seq研究铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制目的铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药机制不尽相同。为了更全面的了解铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制,从而进行本部分研究。方法利用RNA-seq技术对AB菌株进行高通量测序,分析比较二者的差异基因,来研究和探讨铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制。结果A,B菌株各做三个重复样本,进行细菌总RNA的提取,其RNA的质检结果均合格。对RNA-seq测序数据的结果进行一系列的检测和评估,说明测序质量较好,可以进行数据的比对分析。差异基因的筛选结果中,铜绿假单胞菌IPMS株(sample A)与IPMR(sample B)相比,共有差异表达的基因630个,其中297个基因明显上调,333个基因明显下调。其中与耐药基因相关的差异基因共有29个,其中15个基因明显上调,14个基因明显下调。差异基因GO富集,共有162条GO功能注释,其中显著富集(P<0.05)的结果共7条,差异基因经过KEGG富集分析,共得到83条信号通路的功能注释,有4条通过KEGG显著富集,其中耐药相关通路中包括有9个基因。结论通过RNA-seq测序结果中差异基因的研究,铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制有以下几点:膜孔蛋白Opr D基因opr D的表达下调;mex R基因负型调节外排泵MexAB-OprM,mex R基因的表达下降导致MexAB–OprM外排泵的高表达;mex T基因正向调控外排泵Mex EF-Opr N,Mex T高表达能间接诱导外排泵Mex EF-Opr N高表达;ampG基因编码的AmpG蛋白,诱导铜绿假单胞菌β内酰胺酶的产生。