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研究背景Gcm(glial cells missing)基因首先是在果蝇中被发现的。果蝇Gcm基因缺失,神经前体细胞向神经胶质细胞的分化发生障碍,在哺乳动物中发现了Gcm同源性基因Gcm1和Gcm2。Gcm1主要表达于胎盘迷路滋养层细胞,参与合体滋养层细胞分化和绒毛膜的形成;Gcm2是仅在甲状旁腺细胞中有表达的一种转录因子。它在调节胚胎早期甲状旁腺细胞的分化及胚胎后期甲状旁腺细胞的存活中起着至关重要的作用。小鼠胚胎早期敲除Gcm2基因,可观察到小鼠甲状旁腺缺失。人类Gcm2基因的突变可以导致先天性家族性孤立性甲状旁腺功能减退症。研究表明,Gcm2在成体甲状旁腺细胞中仍持续表达,这提示Gcm2基因除在甲状旁腺胚胎发育进程中发挥决定性作用外,可能在成熟的甲状旁腺细胞中仍具有重要功能。然而,关于Gcm2基因的研究目前主要关注其在胚胎发育早期阶段的功能,以传统的基因敲除技术在胚胎早期便敲除了Gcm2基因,无法进一步研究其在成体甲状旁腺细胞中的功能。Cre/Lox P他莫昔芬可诱导性条件性基因敲除技术是近年来普遍运用的一种基因敲除方法。该技术将雌激素受体(estrogen receptor,ER)的配体结合区(ligand binding domain,LBD)与Cre重组酶进行融合,形成一种嵌合重组酶。该嵌合重组酶不能直接入核与Loxp位点相结合,只有在给予外源性他莫昔芬时,才能入核发挥重组作用。如此可实现基因敲除在时间上的把控。本研究利用Cre/Lox P敲除系统,首次建立了他莫昔芬可诱导的Gcm2基因敲除小鼠模型,实现了Gcm2基因敲除在时间上的把控。在小鼠发育成熟后腹腔注射他莫昔芬诱导Gcm2基因的敲除,检测Gcm2基因敲除后小鼠机体的钙、磷代谢情况及甲状旁腺细胞的增殖情况。以此初步探索Gcm2基因在成体小鼠甲状旁腺细胞中的功能,为进一步探究甲状旁腺功能异常基因治疗新靶点提供实验参考依据。研究方法1.通过基因型为Gcm2E2fl/+的F0代小鼠交配繁殖,筛选得到基因型为Gcm2E2fl/fl的F1代小鼠;将其与Cre-ER转基因小鼠进行杂交,获得基因型为Gcm2E2fl/+Cre-ER和Gcm2E2fl/+的F2代小鼠;将F2代小鼠进行自交或与F1代小鼠回交,获得基因型为Gcm2E2fl/flCre-ER的可诱导性条件性基因敲除小鼠;2.6周龄小鼠于腹腔注射他莫昔芬诱导Gcm2基因敲除,连续打药5天;3.采用PCR技术鉴定敲除小鼠基因型;4.采用蛋白质印迹法检测甲状旁腺Gcm2蛋白的表达;5.钙磷测定试剂盒和ELISA检测试剂盒分别检测血清钙、磷、甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)及1,25(OH)2D3浓度变化;6.Ki-67免疫组化染色观察甲状旁腺细胞的增殖变化情况;7.Real-time PCR检测甲状旁腺和胸腺组织Gcm2、PTH及CaSR基因mRNA的表达;8.micro CT检测骨代谢情况。实验结果1.经三代繁育,获得基因型为Gcm2E2fl/flCre-ER的可诱导的条件性基因敲除小鼠;2.他莫昔芬诱导后,PCR检测甲状旁腺组织Gcm2基因呈敲除型;3.与野生型和溶剂对照组相比,Gcm2敲除组小鼠甲状旁腺Gcm2蛋白表达显著下调(P值均<0.05);4.Gcm2敲除组血磷浓度明显升高(P值均<0.05),血钙和PTH浓度显著降低(P值均<0.05),血1,25(OH)2D浓度无明显变化。5.Gcm2敲除后HE染色发现,甲状旁腺细胞形态无明显变化;6.Ki-67免疫组化染色发现,Gcm2敲除组甲状旁腺细胞增殖增强(P值均<0.05);7.甲状旁腺中PTH和Ca SR的mRNA表达显著下调(P值均<0.05)。胸腺PTH mRNA的表达明显上调(P值均<0.05),而CaSR mRNA的表达无明显差异;8.股骨ROI区域的骨体积(BV)、相对骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、厚度(Tb.Th)及骨密度(BMD)均明显增加(P值均<0.05)。结论1.他莫昔芬100 mg/kg连续注射5天可诱导成体小鼠Gcm2基因的敲除。2.成体小鼠Gcm2基因敲除后表现为甲状旁腺功能减退症;3.PTH和CaSR均位于Gcm2下游,成体小鼠Gcm2基因敲除后胸腺细胞可以代偿性产生少量PTH;3.成体小鼠Gcm2基因敲除后,甲状旁腺细胞形态没有变化,发生了代偿性增殖;