论文部分内容阅读
细胞凋亡是生物界广泛存在的一种基本生命现象,其在个体形态形成、形态改变、成体的恒常性的维持以及生物体的防御等方面发挥作用。本研究室的前期工作克隆了人类CXXC5基因,发现其具有导致细胞凋亡的作用。本文是以前期工作为基础深入研究CXXC5基因在细胞凋亡的作用。本文制备了CXXC5的多克隆抗体,利用HEK293T细胞系进行研究获得的结果表明：1)通过Hochest33258检测,该基因的过表达能够诱导HEK293细胞的凋亡。2)Western blot分析结果表明,该基因的过表达能够激活TNF-a的表达,说明CXXC5蛋白通过TNF-a膜受体通路诱导细胞凋亡。3) Western blot分析结果表明,CXXC5蛋白过表达时对P53的蛋白表达水平无影响,说明CXXC5蛋白不通过P53所属的线粒体通路诱导细胞凋亡。4)FADD是细胞凋亡通路中的带有死亡结构域,连接受体和Caspase-8的一个调节分子,Western blot分析表明CXXC5蛋白不与FADD结合,也不激活FADD的表达,但RNA干扰内源性CXXC5的表达,会降低FADD蛋白表达水平。5)利用干扰技术“敲除”CXXC5的表达,通过Western blot分析表明,CXXC5蛋白的失活导致Caspase8和Caspase3蛋白表达的下调,与本实验室前期工作所做的过表达CXXC5蛋白上调Caspase8和Caspase3的表达结果一起证明：CXXC5蛋白通过调控Caspase8和Caspase3的蛋白表达引起Caspase的级联反应。6) Western blot分析过表达CXXC5蛋白时线粒体通路上的BID,细胞色素C和Caspase9的表达情况,结果表明在过表达CXXC5蛋白时这3种蛋白的表达未受影响,说明CXXC5蛋白在激活Caspase8,启动Caspase级联反应后,不通过线粒体途径诱导细胞凋亡。7)通过荧光素酶报告分析,亚细胞定位实验,核质分离实验,Western blot分析以及共免疫实验获得的结果证实,CXXC5与SMAD3和SMAD4相互作用。Western blot分析表明,CXXC5蛋白激活磷酸化的SMAD3的表达,但不激活非磷酸化的SMAD3和SMAD4的表达。进一步分析表明,共转染SMAD3,SAMD4与CXXC5时,TNF-a转录活性有更显著的上升。上述结果表明,CXXC5与SMAD3和SMAD4相互作用,通过TNF-a膜受体通路诱导细胞凋亡。