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猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病，给世界养猪业造成了严重的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。 目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌感染猪引起的临床症状并降低死亡率，但不能降低发病率、慢性感染和阻止肺部病变，对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。可以说，目前采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择，迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。 与灭活疫苗和亚单位疫苗不同，自然感染或试验感染能够诱导抗任何异源血清型的保护。这样，弱毒活疫苗也许是解决当前商品化疫苗不足的一种可行方法。构建胸膜肺炎放线杆菌突变株的传统方法存在很多缺陷。利用化学或转座子介导的突变方法存在随机性，只适合于表型发生明显变化的突变子筛选，而不导致明显表型变化的突变株就不能够通过这些方法获得；而通过同源重组导致靶基因突变方法获得的突变株最后含有抗性标记，由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。本实验室贝为成博士缺失了ApxⅡ的毒力激活因子ApxⅡC的编码基因apxⅡC，获得了基因工程毒力缺失突变株HBC~-／GFP~+，其毒力显著减弱，并能诱导试验动物产生免疫保护，对同血清7型APP的攻击保护率为100％，但对异源血清1型的攻击保护率只有75％。为了进一步提高HBC~-／GFP~+突变株的免疫效力，我们设想以该基因缺失菌株为载体表达ApxⅠ的结构基因apxⅠA，构建新的重组菌株。然而，apxⅠA全长3000多个碱基，采用同源重组的方法引入全长apxⅠA非常困难。鉴于上述背景，本研究确定了ApxⅠ毒素的主要免疫原性区段，试图通过使用同源重组技术和负向选择方法(counter-selection strategy)构建不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡC~-／apxⅠA5~+基因工程突变株，主要研究内容包括： 1．ApxⅠ外毒素N端多肽的免疫原性研究 ApxⅠ外毒素是猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)最重要的毒力因子，为了研究其N端多肽的免疫原性，分别将apxⅠA基因的全长编码区(apxⅠA，3146bp)及其5’端1140bp的片段(apxⅠA5)克隆到原核表达载体pET-28a，经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达，表达产物ApxⅠA和ApxⅠAN均以包涵体的形式存在，Western-blot检测证实两种表达产物均具有免疫反应性。将纯化的重组蛋白(rApxⅠA和rApxⅠAN)和提取的天然毒素ApxⅠ(nApxⅠ)分别经腹腔免疫BALB／c小鼠，于免疫前、免疫2周和4周后分别检测了ELISA抗体和毒素中和抗体水平，结果表明，rApxⅠAN免疫组的ELISA抗体显著低于rApxⅠA免疫组和nApxⅠ免疫组，但rApxⅠAN免疫组血清中和试验中测定的溶血素单位与rApxⅠA及天然nApxⅠ免疫组没有显著差异。第二