老年性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）为年龄相关的一类黄斑疾病,随年龄增加而患病率攀升,其累及黄斑区视网膜及视网膜色素上皮、脉络膜,使视网膜、脉络膜出现病变,引起患者视功能下降,尤其是中心视力进行性降低。AMD是发达国家最为常见的致盲性疾病,尽管AMD的发病机制涉及老化、氧化损伤、炎症、自身免疫、生长因子失衡等多种途径,但是氧化应激在AMD的发病中具有重要作用。视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial,RPE）作为眼部组织细胞代谢最为活跃的细胞,其可以吞噬视网膜光感受器细胞的外界盘膜,继而产生大量脂质过氧化物及H₂O₂,再者RPE长时间暴露于光照下会出现光氧化效应的累积,因此RPE对氧化应激具有较高易感性;RPE损伤则会导致视网膜光感受细胞的功能障碍。此外由于老化,RPE的抗氧化系统的抵抗力会下降。氧化应激及抗氧化能力的下降会导致RPE功能障碍及结构异常,而二者则是AMD公认的重要病理改变。姜黄素为一种分子量相对较低的多酚类化合物,为姜黄最主要的活性成分,具有较强的抗氧化、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗增殖作用,其中具为公认的能力便是抗氧化作用。姜黄素可以改变基因表达,调控多种micro RNA、核因子、细胞因子、酶等多个靶点,而micro RNA及核因子在姜黄素抗氧化机制中发挥有重要作用。为探讨姜黄素对RPE氧化应激的保护机制,本研究观察了姜黄素对H₂O₂诱导RPE氧化应激的保护作用,mi R199a在此保护机制中的作用,氧化应激关键基因产物Nrf2及血红素氧化酶1（heme oxygenase 1,HO-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamyl cysteine synthetase,γ-GCS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、醌氧化还原酶1（quinone oxidoreductase 1,NQO1）等抗氧化酶在姜黄素抗氧化机制中的作用,以及予以mi R199a模拟及抗mi R199a后上述相应分子的变化,并讨论p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）在此抗氧化应激机制中的作用。从抗氧化层面对姜黄素如可保护RPE进行阐述,为AMD的防治提供新的想法和思路。第一部分姜黄素可缓解H₂O₂所诱导ARPE-19细胞的氧化应激目的:研究不同浓度H₂O₂对ARPE-19氧化应激的诱导,对细胞活力的影响,以探寻最适宜诱导ARPE-19细胞氧化应激模型的最佳H₂O₂浓度。筛选适宜预处理干预的姜黄素浓度,并探讨姜黄素对H₂O₂诱导ARPE-19氧化损伤的改善情况。方法:取传代5至7代的ARPE-19细胞,10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、500μmol/L H₂O₂分别作用于ARPE-19细胞18h,采用Cell Titer-Blue对细胞活力进行检测,测定细胞内丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（super oxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）水平,筛选可诱导氧化应激的最合适的H₂O₂浓度。采用Cell Titer-Blue对5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L姜黄素作用6h后ARPE-19细胞的活力进行检测,筛选合适的姜黄素干预浓度,并进一步研究其对H₂O₂诱导ARPE-19细胞氧化应激的影响。结果:100μmol/L H₂O₂培养16h足以引起ARPE-19细胞内氧化水平显著升高、抗氧化水平显著下降,对ARPE-19细胞产生足够的氧化应激引起细胞活力的下降。而10μmol/L姜黄素预处理6h可缓解外源100μmol/L H₂O₂处理18h所诱导的ARPE-19细胞内MDA的升高及SOD、GSH-Px活力的下降,以及细胞活力的下降。结论:H₂O₂可诱导ARPE-19细胞氧化应激,引起MDA增加、SOD及GSH-Px活力下降,细胞活力下降,成功构建氧化应激模型;而姜黄素则可缓解外源H₂O₂诱导ARPE-19细胞的氧化应激损伤。第二部分mi R199a/Nrf2通路在姜黄素缓解H₂O₂所诱导ARPE-19氧化应激中的作用目的:探讨mi R199a/Nrf2及其下游的HO-1、γ-GCS、NQO1在姜黄素缓解H₂O₂所诱导的ARPE-19细胞氧化应激损伤中的作用及其机制。方法:对0μmol/L姜黄素6h+0μmol/L H₂O₂处理18h、10μmol/L姜黄素6h+0μmol/L H₂O₂处理18h、0μmol/L姜黄素6h+100μmol/L H₂O₂处理18h、10μmol/L姜黄素培养6h+100μmol/L H₂O₂处理18h,四种条件下ARPE-19细胞mi R199a表达水平,Nrf2 m RNA、蛋白表达水平及其靶基因HO-1、γ-GCS、NQO1的m RNA、蛋白表达水平的变化。结果:姜黄素可抑制H₂O₂引起的ARPE-19细胞mi R199a水平的上升及Nrf2蛋白质、m RNA表达水平的下降,逆转H₂O₂引起的ARPE-19细胞HO-1、γ-GCS、NQO1在m RNA、蛋白表达水平的下降。结论:姜黄素可抑制H₂O₂引起的ARPE-19细胞mi R199a表达,继而上调Nrf2 m RNA、蛋白质水平表达,上调Nrf2靶基因HO-1、γ-GCS、NQO1 m RNA、蛋白质水平的表达,藉此实现其抗氧化作用。第三部分mi R199a对ARPE-19细胞Nrf2及其靶基因表达的影响目的:通过构建、转染mi R199a-mimic序列来模拟mi R199a的作用,观察、探讨mi R199a对Nrf2及其靶基因表达的作用;通过构建、转染anti-mi R199a序列来探讨、研究将mi R199a表达下调后Nrf2及其靶基因表达的变化,藉此揭示mi R199a对Nrf2、Nrf2靶基因表达的影响及mi R199a、Nrf2在姜黄素抗氧化机制中的作用。方法:通过构建、转染mi R199a-mimic序列和anti-mi R199a序列来实现对mi R199a上调或抑制,并对mi R199a上调或抑制后Nrf2及其靶基因m RNA、蛋白表达水平的变化进行观察。结果:mi R199a-mimic转染可显著抑制ARPE-19细胞Nrf2及其靶基因HO-1、γ-GCS、NQO1的m RNA、蛋白表达水平;anti-mi R199a转染可显著增加ARPE-19细胞Nrf2及其靶基因HO-1、γ-GCS、NQO1的m RNA、蛋白表达水平。结论:转染mi R199a-mimic序列可模拟mi R199a高表达的作用,增加mi R199a可以导致Nrf2及其靶基因在m RNA、蛋白质水平表达的下调;转染anti-mi R199a序列可以成功模拟姜黄素对Nrf2及其靶基因表达的改变,重现mi R199a下调后Nrf2及其靶基因表达的变化,即姜黄素可以通过抑制mi R199a表达来实现对Nrf2及其靶基因表达的上调。第四部分姜黄素对Nrf2核转位的影响及p38 MAPK在姜黄素Nrf2抗氧化中的作用目的:探讨姜黄素对Nrf2分布、核转位的影响,通过联合p38MAPK特异的抑制剂SB203580,进一步观察、研究p38MAPK对Nrf2蛋白表达的影响,探讨p38MAPK在姜黄素Nrf2抗氧化中的作用。方法:测定0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L姜黄素培养6h后ARPE-19细胞核内Nrf2水平及核内Nrf2（nuclear Nrf2,nuc-Nrf2）与总Nrf2（total Nrf2,T-Nrf2）比值的变化。测定0μmol/L、20μmol/L SB203580预处理2h,而后0μmol/L、10μmol/L姜黄素再培养6h后Nrf2水平及Nrf2靶基因HO-1、γ-GCS、NQO1的m RNA、蛋白表达水平的变化。结果:姜黄素不仅可以增加ARPE-19细胞Nrf2的表达,还可增加Nrf2的核转位,增加细胞核内Nrf2水平。p38MAPK特异抑制剂SB203580预处理可抑制p38MAPK磷酸化水平,可抑制姜黄素引起的Nrf2及其靶基因蛋白的表达,也即p38MAPK可能参与了Nrf2介导的姜黄素对ARPE-19细胞氧化应激缓解过程。结论:姜黄素不仅可促进Nrf2表达,还可增加Nrf2的核转位,增加细胞核内Nrf2的水平;p38MAPK可能参与姜黄素缓解H₂O₂诱导ARPE-19细胞氧化应激中Nrf2介导的调控过程。