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木薯是以块根淀粉为主要储能物质的新型能源、工业原料和粮食作物。木薯是一种C3植物,但其光合效率却比普通C3植物高得多,许多特征类似C4植物,但是木薯块根中储藏光合产物的量不足叶片中合成光合产物量的1/5,提高光合同化物从叶(源)到块根(库)的转化率对木薯淀粉积累意义重大。细胞壁蔗糖转化酶在木薯淀粉积累过程中主要负责将叶片中合成的蔗糖等光合产物通过韧皮部运输到“库器官”根中,是决定作物产量和植物生产力的决定性因素。启动子在调控基因转录环节中起着关键作用,也是基因工程表达载体的一个重要元件,因此研究启动子的功能序列对认识基因表达调控的机制具有非常重要的意义。本研究根据已知的木薯细胞壁转化酶基因MeCWINV3编码区序列与木薯基因组数据库中预测的MeCWINV3基因序列信息设计引物,从木薯基因组DNA中对该基因的潜在启动子区进行PCR扩增,经测序比对成功获得1351 bp序列,其中包含191 bp编码区序列和1160 bp潜在启动子区序列。用PlantCARE和PLACE软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子包含CAAT box和TATA box保守元件、大量光反应相关元件和应对高低温胁迫和激素响应相关元件。通过生物信息学对MeCWINV3基因启动子序列的分析,根据其上可能存在的胁迫相关的顺式调控元件信息,选取100 μM SA、30 μM GA3、1%乙烯利和30 μMABA四种外源激素胁迫,以及4℃、16℃低温胁迫处理SC8木薯组培苗,利用实时荧光定量PCR技术,研究MeCWINV3基因在不同胁迫处理下的表达模式。结果表明,MeCWINV3基因的表达受逆境和激素胁迫的调控,由此推断MeCWINV3基因启动子可能存在与该基因逆境和激素胁迫下表达变化有关的相对应顺式作用元件。利用5’端缺失法对MeCWINV3基因启动子进行缺失突变,得到6段长度不同的突变体。进而将这6段启动子片段取代pVKH表达载体中的CaMV35S启动子与GUS连接,构建成融合表达载体pVKH-CW3-GUS,通过农杆菌真空渗透法转化拟南芥并稳定表达,对启动子活性进行GUS定性分析,发现其驱动了GUS 基因在拟南芥中表达,具有启动活性。利用酵母单杂交技术初步筛选与MeCWINV3基因启动子结合的上游转录调控蛋白。在对MeCWINV3分段突变启动子GUS活性分析的基础上,选取其核心序列并克隆获得CW3片段,将其与酵母单杂交报告载体pAbAi连接构建诱饵载体CW3-pAbAi,转化酵母菌株Y1HGold获得诱饵菌株Y1HGold[CW3-pAbAi]。提取木薯总RNA,构建ds cDNA文库。把ds cDNA和pGADT7-Rec载体共转化诱饵酵母菌株感受态,通过两次SD/-Leu/AbA培养基筛选,对阳性克隆测序结果在NCBI数据库进行BLAST同源性比较分析显示,成功筛选到多条与MeCWINV3启动子区结合的蛋白的基因序列,主要有过氧化氢酶CAT1、脱落酸不敏感蛋白5、脱落酸受体PYL8、金属硫蛋白、脯氨酸富集蛋白PRCC、干旱胁迫相关因子、液泡蛋白分选相关蛋白等。