研究背景及方法肝脏是维持体内血糖稳态的核心器官,正常时负责循环中80%葡萄糖的释放。其中50%源自肝糖原分解,剩下的由肝糖异生。正常情况下,肾脏储存的少量糖原通过糖异生发挥作用。空腹条件下,糖异生作用增加,其负责循环中葡萄糖的比例随着空腹时间的延长和体内糖原储备的下降而升高,空腹24小时约70%,而空腹48小时可达90%以上。因此,糖原分解和糖异生,特别是糖异生是保证空腹时血糖稳定和脑、肾等重要器官能量供应的先决条件。而这两条途径的最终末反应,即从葡萄糖6磷酸到葡萄糖的过程,是在内质网腔内由葡萄糖6磷酸酶催化的。机体血糖的稳态离不开神经内分泌的调节。作为主要的升糖激素,糖皮质激素(glucocorticoids, GC)在应激、糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖等代谢性异常中有重要作用。循环中糖皮质激素主要来源包括：1.肾上腺皮质：受下丘脑-垂体-肾上腺轴调控；2.局部器官：肝脏、脂肪组织等,其中肝脏约占1/3,肝外组织约2/3(主要为脂肪细胞)。其生成主要在内质网中,11p-羟基类固醇脱氢酶1(11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1,11β-HSD1)催化无活性的皮质酮转化成有活性的皮质醇。在细胞水平,糖皮质激素通过结合糖皮质激素受体发挥生理作用,糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)属于核受体超家族,包括正常的GRa和变异片段GRβ两类亚型。GR位于细胞浆,与热休克蛋白(heat shock protein 90, HSP90)形成二聚体。糖皮质激素通过扩散作用或其他转运机制进入细胞浆与受体结合后,受体的原有构象发生变化,HSP90从受体解离出去,而与糖皮质激素结合的受体则转移进入细胞核内,通过两种机制引起靶基因转录的改变：1.以二聚体形式,通过结合位于受调控基因启动子内的糖皮质激素反应元件(glucocorticoid response element, GRE),进一步改变靶基因转录；2.以激素-受体复合物形式,通过调节其他转录因子,进一步影响靶基因的转录。然而,有研究发现GC存在调节细胞生物活性的非基因调控途径,并且外周组织生成的皮质醇可局部放大GR激活后的效应。内质网腔内氧化还原状态对其功能有重要影响。正常情况下,高浓度的NADPH/NADP+比率使11β-HSD1具有还原酶活性,以利于活化糖皮质激素。内质网腔内NADPH生成主要由H6PDH催化G6P代谢生成。由于G6P是G6Pase催化生成葡萄糖的底物,因此内质网腔内的酶学反应将葡萄糖代谢和糖皮质激素代谢紧紧相连。本研究在既往研究发现及目前研究现状基础上,推测内质网腔内存在G6P池供H6PD和G6Pase利用,且氧化还原状态的改变可导致G6P的重新分配利用,参与葡萄糖代谢。因此,本实验主要围绕皮质醇、肝细胞内质网氧化还原状态及葡萄糖代谢的关系,利用酶反应动力学原理,分别从以下方面进行研究：(1)应用不同G6Pase抑制剂及不同浓度G6P,观察葡萄糖和二氧化碳的变化,探究内质网腔内存在G6P池；并通过酶动力学计算,明确H6PDH和G6Pase是否平均分配利用G6P；(2)在不同G6P浓度下,观察不同浓度皮质醇、皮质酮对葡萄糖和二氧化碳生成的影响；(3)应用皮质醇、皮质酮及11β-HSD1抑制剂,观察NADPH的变化。由于目前对NADP是否能通过完整内质网膜仍有争议,本研究还观察不同时间下NADPH的变化。通过上述系统研究,明确皮质醇通过11β-HSD1改变腔内NADPH/NADP对葡萄糖合成的刺激作用,为进一步阐明神经内分泌对糖代谢的调节提供实验依据。主要研究结果：1.G6P通过G6PT自细胞浆转运至内质网腔内后,形成一个G6P池,作为G6Pase和H6PDH的底物参与相应反应。但通过酶反应动力学方程计算发现,这两个酶利用G6P的比例并不均等。2.尽管既往有研究认为完整ER膜对NADP没有通透性,但本研究通过长时间孵育(30分钟)发现NADP可以缓慢透过完整ER膜。3.皮质醇可以通过11β-HSD1改变内质网腔内的NADPH/NADP+比率,使内环境成还原状态。4.通过改变内质网腔内氧化还原环境,H6PDH利用G6P受限,更多的G6P通过被G6Pase利用,葡萄糖生成增加。主要研究结论：空腹状态下,升高的皮质醇通过11β-HSD1改变内质网腔内氧化还原状态,并进一步影响G6P的酶反应利用,刺激葡萄糖生成,且G6P浓度越低,刺激作用越明显。这一潜在机制对进一步阐明糖代谢与激素调节的关系及相关疾病的研究提供了新的研究靶点,具有重要意义。