质粒DNA (plasmid DNA)是基因工程的重要载体,从细胞内提取质粒已成为实验室中经常性的基础工作,构建快捷、简单、经济、易于自动化和环境友好型的供体细胞富集和质粒DNA纯化方法具有重大意义。建立在磁性固相载体基础上的纯化方法可使细胞或DNA直接从液体粗原料中钓出,免去了离心、沉淀等纷繁复杂的中间步骤,因而自二十世纪90年代以来得到重大发展,但已报道的磁性载体对核酸的纯化能力普遍偏低,使其应用受到限制。对于细胞富集,免疫磁性分离法虽行之有效但却受制于样品制备、生产成本和储藏寿命,不适于批量菌体分离,而基于非特异性吸附反应富集细胞的磁性分离手段却鲜见文献报道。同时,已报道的磁性分离法从大肠杆菌中提取质粒DNA时仍需两次以上离心操作：一次是从液体培养基中回收细胞,另一次是去除变性的基因组DNA／蛋白质复合体。而离心是个耗时、劳动密集型操作,对生物大分子的剪切力较大,离心介入后不易实现高通量样品分析的自动化、微型化和集成化。针对以上问题,本研究提出了制备高吸附容量、pH敏感型、多功能羧基功能化磁性纳米粒子(carboxyl-functionalized magnetic nanoparticles, CMNPs)的技术；利用其构建集细胞捕获、变性基因组DNA／蛋白质复合体去除和质粒DNA捕获于一体的技术路线；提出基于共絮凝行为富集微生物和核酸的思路；建立无RNase介入分离质粒DNA的方法,主要工作及结果如下：1.以FeCl3, FeSO4, NaOH为原料,采用化学共沉法制备了Fe304磁性纳米粒子。分别以Bis[2-(methacryloyloxy) ethyl] phosphate为偶联剂、甲基丙烯酸为功能单体、过硫酸钾为引发剂,控制反应温度,通过超声辐照原位聚合技术制备了羧基功能化磁性纳米粒子。结果表明超声空化作用下铁氧体可以成为聚合反应的活性中心,超声功率越大则产物的粒径越小,在400、600和800W超声功率下产物的平均粒径分别为96.87、55.97749.61nm; TEM和XRD表明产物为尖晶石铁氧体,粒径约7nm; FTIR分析证明聚甲基丙烯酸对铁氧体纳米粒子的成功包覆；TGA-DTG分析表明包覆层含量为7-12%；VSM测试表明包覆后饱和磁化强度为47emu／g,具有较强磁响应性；对pH敏感,在中性环境中5min内可悉数回收,而在酸性条件下达到相同的回收率则小于2.以“捕获率”和捕获后“菌体/CMNPs复合体在管壁上吸附的牢固程度”为指标,对有潜力使CMNPs与大肠杆菌结合的20种化学试剂进行了筛选鉴定,发现酸、钙盐和锌盐是有效的“偶联剂”。对表现最好的盐酸和氯化钙辅助CMNPs捕获大肠杆菌的条件进行了优化。结果表明,大肠杆菌的捕获效率随pH降低而急剧升高,在pH 5左右达到较平稳的值。细胞浓度越高,CMNPs用量越多,磁分离时间越长,则相同条件下捕获率也越高。在较优的条件组合下(细胞OD600大于0.2,粒子用量为0.85mg,磁分离时间3min, pH值3.5-1.5)可以捕获90%以上的大肠杆菌。以氯化钙作为“结合液”时,钙离子与菌体浓度的比值决定了大肠杆菌的捕获效率,二者之间关系可用Logistic模型函数拟合,并受CMNPs用量和磁分离时间的影响。在捕获行为中,钙离子可能起到离子桥作用,通过与纳米粒子的羧基和菌体表面的活性基团发生配位,形成菌体/CMNPs复合体。3.以CMNPs为固相载体,基于SPRI(solid phase reversible immobilization, SPRI)法对大肠杆菌粗裂解液中的质粒DNA进行了纯化研究。结果表明：质粒DNA回收量与结合液浓度之间存在临界关系,当PEG8000>0.15g/mL, NaCl浓度>0.5mol／L时才能获得稳定的质粒DNA收率。质粒DNA回收量随着CMNPs用量的增加而增加,超过最佳值后因不可逆吸附或妨碍洗脱收率反而下降。质粒DNA在纳米粒子表面的吸附与解吸附是快速过程,所需平衡时间分别为150s和40s。0-70℃之间,温度升高对质粒DNA在CMNPs表面吸附影响不大而RNA吸附量急剧下降。利用温度“调谐”差示吸附DNA和RNA的现象,建立了不需要RNase预处理而提取较纯质粒DNA的方法。4.建立了基于CMNPs快速、小量制备质粒DNA的方案。该法整合大肠杆菌捕获、裂解液去杂和质粒DNA富集于一体,操作简单,无需离心,对仪器的依赖性较低且不涉及有毒试剂；质粒DNA质量高,主要以超螺旋构象存在,A260/A280比值大于1.75,可满足酶切等一般的分子生物学实验要求。产量和质量同QIAGEN公司的标准提取试剂盒法相当但成本只有其1／5,整个过程用时不到20min,短于试剂盒法和醇沉淀法。本法特别适用于高通量、自动化、微型化和集成化样品提取和分析平台的构建。5.现已报道的磁性载体核酸分离方法,对常规盐离子含量较低(折合NaCl浓度<0.5mol／L)的样品(如PCR产物),要么用到高浓度高离液序列盐(chaotropic)创造吸附或洗脱条件,对核酸具有损伤作用并造成体积放大；要么用高系黏度结合液,降低了磁性粒子的可控性,且生产成本高、环境不友好。针对以上问题,本研究提出了以生物相容性极强的精胺和亚精胺作为CMNPs/核酸“结合液”,以脱盐质粒DNA／RNA为核酸供体,构建了一种新的核酸富集方法。结果表明：精胺和亚精胺作为结合液时,CMNPs对质粒DNA和RNA选择吸附性不显著。以亚精胺为结合液时,质粒DNA在1～2mmol／L亚精胺浓度内在CMNPs表面吸附；而RNA在0.5-5.5mmol／L之间具有普遍的吸附能力,但最大吸附同样在1～2mmol／L浓度范围。以精胺为“结合液”,CMNPs对质粒DNA的吸附率在1～7mmol／L浓度内达100%；而对RNA吸附率在1.5～5mmol/L浓度之间接近90%,约10%小分子RNA不能被吸附。延长时间可提高核酸的回收率,孵育5min之内可达到100%吸附。凝聚试剂被充分剔除后核酸的解吸附率可达100%。精胺辅助CMNPs富集核酸的能力远强于亚精胺,以其作为结合液时CMNPs对核酸饱和吸附量可达2pg核酸／μg载体。6.对于低盐浓度核酸溶液,降低pH也可驱使其在CMNPs表面高效吸附。在碱性溶液中(pH>8.0), CMNPs几乎不吸附核酸；而在酸性溶液中,CMNPs对核酸的吸附率可达100%。可见,DNA/RNA在羧基纳米粒子表面的吸附与否,可通过pH调控迅速开启或关闭。