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目的:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)与血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)结合所引起的信号转导是血管生成的限速步骤,在整个血管生成过程中发挥最为关键的作用。由于VEGFR2主要表达在肿瘤相关血管内皮细胞以及妊娠和伤口愈合时活在化的血管内皮细胞表面,因此,VEGFR2是抗肿瘤血管生成治疗的重要靶点。若能通过疫苗免疫,打破针对VEGFR2的自身免疫耐受,诱导VEGFR2特异性的免疫应答,破坏表达VEGFR2的血管内皮细胞——即抗肿瘤血管生成主动免疫治疗,则是抗肿瘤血管生成治疗最经济、最有效的方法。业已发现,编码主要组织相容性复合体(MHC)I类分子重链-?2微球蛋白(?2m)-CD8+T细胞抗原表位(即单链三聚体——single chain trimer,SCT)的DNA疫苗皮内免疫,能显著诱导该抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答,有效清除病原体感染和杀伤肿瘤细胞。表位分析发现,小鼠VEGFR2有3个H-2Db限制性的CD8+T细胞表位,分别称为KDR1,KDR2(aa400-408)和KDR3。本研究旨在构建表达MHC I类分子重链(H-2Db)-?2m-KDR2单链三聚体的DNA疫苗(SCT-KDR2),研究其皮内免疫后的抗肿瘤转移作用和相关机制。方法:通过分子生物学技术构建表达H-2Db-?2m-KDR2单链三聚体DNA疫苗[pc DNA3.1(+)-KDR2-?2m-H-2Db,即SCT-KDR2]以及表达H-2Db-?2m-卵白蛋白抗原表位(OVA,aa257-265)单链三聚体DNA疫苗[pc DNA3.1(+)-OVA-?2m-H-2Db,即SCT-OVA]。通过流式细胞术检测SCT-KDR2 DNA,SCT-OVA DNA在人A293胚胎肾细胞系中的表达。对C57BL/6小鼠进行SCT DNA疫苗皮内免疫,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL活性。以藻酸钠小珠法和免疫组化法检测肿瘤细胞诱导的血管生成。以小鼠肿瘤转移模型(B16黑色素瘤小鼠肺转移模型,3LL Lewis肺癌小鼠转移模型),观察SCT-KDR2皮内免疫后的抗肿瘤转移作用。结果:1)通过提取C57BL/6小鼠脾细胞总RNA,经RT-PCR,成功克隆?2m和H-2Db c DNA,正确构建了重组质粒pc DNA3.1(+)-KDR2-?2m-H-2Db和pc DNA3.1(+)-OVA-?2m-H-2Db)pc DNA3.1(+)(Vector)、SCT-KDR2和SCT-OVA。2)DNA转染A293细胞,通过流式细胞术证实所构建的SCT在转染的细胞高表达。3)SCT-KDR2皮内免疫能打破针对VEGFR2的自身免疫耐受,诱导VEGFR2特异性的CTL应答,杀伤VEGFR2+的靶细胞。4)SCT-KDR2皮内免疫能显著抑制肿瘤诱导的血管生成:SCT-KDR2组小鼠藻酸钠小珠中FITC-dextran的摄取量显著低于对照组;SCT-KDR2组VIII因子相关抗原的表达显著减少。5)SCT-KDR2皮内免疫能显著抑制肿瘤的转移:无论是B16黑色素瘤小鼠肺转移模型,还是3LL Lewis肺癌小鼠转移模型,皮内注射SCT-KDR2 DNA疫苗组小鼠肺转移灶数目显著减少。6)SCT-KDR2皮内免疫不影响预存肿瘤的生长和预存肿瘤小鼠的生存期。结论:1)正确构建了重组质粒pc DNA3.1(+)-KDR2-?2m-H-2Db和pc DNA3.1(+)-OVA-?2m-H-2Db。2)所构建的SCT-KDR2和SCT-OVA DNA能在A293细胞表达。3)SCT-KDR2 DNA疫苗皮内免疫能打破自身免疫耐受,诱导针对VEGFR2的CTL应答。4)皮内注射SCT-KDR2 DNA疫苗能显著抑制肿瘤诱导的血管生成。5)皮内注射SCT-KDR2 DNA疫苗具有显著的抗肿瘤转移作用,但对预存肿瘤的生长无显著影响。