【摘 要】
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生物酶催化剂具备高特异性、高催化性能和绿色无污染等特点,但在实际应用中存在诸多限制,比如反应条件苛刻、无法连续作业等。生物矿化是在生物体内将有机物、无机物、软物质以及硬材料相联系而形成有机-无机复合材料的过程,可以为生命体提供良好的机械保护作用。基于此原理,可利用仿生矿化为不具备自矿化能力的酶进行固定化,从而改善酶的应用性能。在本论文中,通过仿生矿化的方法一步合成了酶-磷酸铜杂化纳米花固定化酶和酶
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生物酶催化剂具备高特异性、高催化性能和绿色无污染等特点,但在实际应用中存在诸多限制,比如反应条件苛刻、无法连续作业等。生物矿化是在生物体内将有机物、无机物、软物质以及硬材料相联系而形成有机-无机复合材料的过程,可以为生命体提供良好的机械保护作用。基于此原理,可利用仿生矿化为不具备自矿化能力的酶进行固定化,从而改善酶的应用性能。在本论文中,通过仿生矿化的方法一步合成了酶-磷酸铜杂化纳米花固定化酶和酶-金属有机框架固定化酶,新型固定化酶具备优异的催化能力可应用于菊花样品中天然活性成分的提取和葡萄糖的可视化检测。具体内容如下:（1）通过一步仿生矿化法,无需提前制备载体而直接从细胞裂解液中分离和固定化His标签重组β-葡萄糖苷酶（BglucLH）。实验制备了纳米花瓣组装的具有微米尺度花状结构的BglucLH-Cu3（PO4）2纳米花（BglucLH-NF）,这种纳米花具有酶载量高、稳定性好、可循环利用的优势;His标签增强了酶与铜离子的特异性结合,与无His标签的β-葡萄糖苷酶（Bgluc）制备的Bgluc-Cu3（PO4）2纳米花（Bgluc-NF）相比,BglucLH-NF的酶活回收率和分离效率分别提高了253.2%和290.1%,这表明了His标签在提高酶的分离效率和固定化效率两个方面均具有明显的作用。（2）基于仿生矿化法成功制备了混合酶（纤维素酶与β-葡萄糖苷酶）的磷酸铜杂化纳米花。纤维素酶与β-葡萄糖苷酶在25:25的用量时达到良好的酶活回收率（95.1±2.81%）,包埋率（82.6±2.36%）和相对酶活（115.1±2.82%）。利用Cellulase&Glucosidase-Cu3（PO4）2杂化纳米花（Cellu&Glu-CuP）酶解反应耦合甲醇溶剂提取工艺,在50℃、40 min内实现菊花中黄酮类活性成分的提取。对比混合游离酶,Cellu&Glu-CuP具有优异的耐高温性能及耐有机溶剂性能。菊花中总黄酮、槲皮苷和槲皮素的产率最高可达7.51%,0.1483%和0.6231%,对比于不添加酶的情况分别提高了43%、39%以及74%,Cellu&Glu-CuP酶解耦合甲醇溶剂提取工艺具有良好的应用潜力。（3）本试验制备了一种强化底物富集的3-巯基苯硼酸/葡萄糖氧化酶@ZIF-8固定化酶（3-MPBA/GOx@ZIF-8）。一方面,基于苯硼酸基团与葡萄糖之间的亲和吸附作用,实现对葡萄糖底物的强富集作用;另一方面,基于巯基官能团与Zn2+的配位作用加速成核,快速制备3-MPBA/GOx@ZIF-8。其中,GOx的最佳负载量可达470 mg/g,同时3-MPBA/GOx@ZIF-8的米氏常数Km和催化效率kcat/Km分别为0.03±0.02 M和63.87±1.96 s-1 M-1,是游离GOx的10倍以上。另外,3-MPBA/GOx@ZIF-8在化学试剂和高温条件下均表现出良好的生物活性并且具有良好的可重复利用性,循环7次后活性保留约80.8%。研究表明,3-MPBA/GOx@ZIF-8具有较高的包埋率、催化效率和增强的稳定性,基于这些特点实现了一种新型的糖尿病视觉比色传感器,为葡萄糖分析提供了一种新的策略。
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