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研究目的：目前全球约有四亿慢性乙型肝炎(CHB)患者,全世界每年约有一百万人死于乙肝导致的肝癌和肝硬化,其中超过三分之一的病例发生在我国。世界卫生组织也已将HBV划为自然存在的人类最重要的致癌因素之一。HBV的感染给我国人民的身体健康造成了严重危害,也给国家和社会带来了沉重的经济负担。在CHB的临床治疗实践中,因同时兼具直接抗病毒和免疫调节功能,干扰素-α(IFN-α)及其衍生物成为抗病毒治疗的一线用药,特别是对于年龄较小、病毒载量较低、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平较高的患者,以IFN-α为主的治疗具有非常明显的优势。但由于普通干扰素分子质量较小,血浆半衰期较短,需频繁地注射给药,患者的依从性较差；而聚乙二醇化的IFN-α(Peg-IFN-α),虽然血浆半衰期有所提高,但其生物学活性明显降低,此外两者都具有较严重的不良反应,限制了其疗效的进一步发挥。因此,如何提高IFN-α的疗效对HBV的治疗起着至关重要的作用。随着分子生物学技术和分子药物学的不断充实和发展,以基因和细胞工程为基础的基因治疗,为人类攻克众多疾病带来了新的希望。基因治疗具有传统药物疗法所不具备的特殊优势,包括持续给药、靶向给药等。因此,我们提出采用含有人IFN-α基因的质粒为载体,以期增强IFN-α的局部表达,探索优化干扰素产生和应答的持续时间,从而取得更好的抑制HBV效果,为设计和利用基于IFN-α的新型抗HBV基因工程药物提供有益的启示。研究方法：首先,以含有HBV基因的人肝癌细胞系HepG2.2.15及其不含HBV的对照细胞HepG2为研究模型,采用脂质体将重组质粒pSecTagB-IFN-a转入肝癌细胞,通过半定量RT-PCR和ELISA检测转染后IFN-α的表达情况；然后,用实时定量PCR、ELISA,检测转染pSecTagB-IFN-α后对HepG2.2.15细胞中HBV复制、转录及抗原表达等的影响,以此作为评价内源性表达的IFN-α抗病毒生物学效应的指标；随后,采用半定量RT-PCR、实时定量PCR、western blot对内源性表达的IFN-α抗HBV效应的机制进行探讨,检测转染后对JAK-STAT信号通路活化及抗病毒蛋白表达的影响：采用实时定量PCR和ELISA,比较内源性表达IFN-α与外加IFN-α对HBV的作用效果,以及比较内源性表达IFN-α啦米夫定联用与外加IFN-α和拉米夫定联用后对HBV复制、转录及抗原表达等的影响；最后采用流式细胞术和半定量RT-PCR检测内源性表达的IFN-α对肝癌细胞表面MHC I和Fas分子的影响。研究结果：(1)重组质粒(pSecTagB-IFN-a)可在肝癌细胞中有效表达。采用pSecTagB-IFN-a转染HepG2.2.15和HepG2细胞在其细胞上清中均可检测到较高水平IFN-α的分泌。(2)转染后IFN-a的表达抑制了HepG2.2.15细胞中HBV的复制。在肝癌细胞HepG2.2.15中内源性表达的IFN-α可产生以HBs、HBc的基因水平及HBVDNA载量、e抗原和表面抗原的下降为主要特征的抗HBV作用。(3) IFN-α的表达激活了JAK-STAT信号通路并诱导抗病毒蛋白的产生。转染pSecTagB-IFN-a后可使细胞中的JAK-STAT信号通路激活,促进了肝癌细胞中抗病毒蛋白ISG15、OAS-1、IFIT-1和IFIT-3的表达。(4)转染pSecTagB-IFN-a后肝细胞中双链RNA受体上调。内源性表达的IFN-a,使RIG-I、MDA-5、LGP-2、PKR和TLR3在肝癌细胞中的表达都有不同程度的上调。(5)内源性表达的IIN-α比外源IFN-α有更强的抗HBV作用。在HepG2.2.15细胞中,转染IFN-α表达载体与同等剂量的IFN-α胞外刺激相比,转染pSecTagB-IFN-α有更为明显的抗HBV作用,包括HBx、HBs、HBc的基因水平及HBV DNA载量、e抗原和表面抗原的降低。(6)内源性表达的IFN-α与拉米夫定联合使用具有更明显的抗HBV效果。转染pSecTagB-IFN-α与拉米夫定联合使用可产生比外加IFN-a与拉米夫定联用组更为明显的HBx、HBs、HBc的基因水平及HBV DNA载量、e抗原和表面抗原的下降。(7)转染pSecTagB-IFN-a可增强MHC I和Fas的表达。内源性表达的IFN-α可在一定程度上上调肝癌细胞表面MHC I和Fas的表达水平。结论及意义：本实验采用含有人IFN-α基因的重组质粒(pSecTagB-IFN-α)转染肝癌细胞,可在细胞上清中分泌较高水平的IFN-α并发挥对HBV的抑制功能。通过机制研究发现,转染IFN-α表达载体后促进了一系列抗病毒蛋白和双链RNA受体的表达,与等剂量的外源性IFN-α刺激相比,内源性表达IFN-α具有更为显著的抗HBV作用,与拉米夫定联合应用后也显示出比对外加IFN-α和拉米夫定连用组更明显的HBV抑制作用。该研究为以IFN-α为基础的新型抗HBV药物的研究提供有益的启示,同时可为基因治疗与传统药物疗法的结合提供新的途径。