研究背景当今,重型肝炎、肝衰竭以及肝癌是我国肝病患者死亡的主要原因,肝移植是治疗此类疾病最有效的方法。但是,人类同种器官移植供体的日益短缺已经成为限制器官移植的关键因素,许多患者因得不到及时的肝移植手术而丧失存活机会。目前,解决这一难题的主要可能途径有异种移植、组织工程和干细胞技术等。组织工程和干细胞技术虽然也是可行途径,但是距成功构建有功能的器官和组织仍有相当一段距离；而异种移植是人们多年来探索的另一可行途径,通过艰苦努力已获得较大进展。异种移植,即将动物的器官、组织或细胞移植到其他种类受者,是一种可能有效缓解同种器官移植供体短缺的方法。鉴于伦理道德的要求、生长特征、器官大小和生理特征等方面的考虑,目前研究者首选猪作为异种移植的最佳种系来源。尽管猪到人的实体器官移植目前仍未实现,但是猪的组织、细胞作为人体病变组织的替代品已在临床逐步得到应用。但是,同时也出现了两大难题：一是供体与受体间可能出现强烈的免疫排斥反应,二是可能出现病毒和病菌在种间传播。目前,猪的α-1,3-半乳糖基转移酶基因的敲除克服了免疫排斥反应。但是,猪细胞、组织和器官携带有猪内源性逆转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV),它属于RNA病毒,感染细胞中存在前基因组或称前病毒DNA,由前病毒DNA转录合成病毒RNA,由宿主以孟德尔遗传方式遗传给后代。正常情况下,由于长时间的进化,前病毒发生了突变不能合成蛋白,从而其天然宿主不致病。然而,一旦跨越了种间屏障,他们可能在新宿主体内增殖并致病。Lieber等发现与PERV高度同源的鼠内源性逆转录病毒可使长臂猿发生白血病。由于PERV不能通过在无特定病原体条件下饲养或者简单的异型杂交育种来消除,猪-人异种移植中仍潜在着PERV种间传播和致病的风险。PERV是整合到猪的基因组中的哺乳动物C型逆转录病毒,具有gag, pol,env三个功能基因和3’,5’端的末端重复序列结构。Patience等根据基因序列比较,将PERV分为两类,即Y类(1-5)和p类(1-4),已证实γ1类有感染性,其他类尚未证实有感染性。目前,人们的对PERV的研究主要集中于具有感染性的γ1型PERV,根据其env基因上的SU区域的差异,将γ1型PERV分为A、B、C三种亚型；其中PERV-A、B有更广泛的宿主范围,在体外可以感染多种细胞,包括貂、鼠以及人的细胞系,而PERV-C在体外仅能感染两种猪细胞系和一种人细胞系。自Patience等首次报道了从猪PK15细胞系中自发释放的PERV在体外可以感染人细胞系之后,异种移植中可能发生PERV在种间传播的潜在危险引起了人们的广泛关注。异种组织器官移植过程中,内皮细胞位于异种移植物和受体接触面,是引起PERV感染的首要因素。Kuddus等发现PERV在体外能感染人的血管成纤维细胞、血管内皮细胞等,而且通过逆转录活性检测证明PERV在感染细胞内复制明显。Wison等发现两个猪系的外周血单核细胞(Peripheral blood monouclear cells, PBMCs)受到促有丝分裂刺激时均可以释放PERV颗粒,并且在体外可以感染猪和人的细胞系。国外的研究报道中,发现PERV可在体外感染多种人源细胞系,如来源于T细胞、骨髓细胞、NK细胞及肾脏细胞系,但这些结果多局限于细胞系及血液中细胞,对人体实质器官细胞的PERV易感性研究较少。在体外培养过程中发现PERV-A与PERV-C的重组体PERV-A/C,它对人细胞株的易感性比PERV-A大约增强500倍。现在为止,在接受猪移植物的人、非人灵长类和其他动物体内,还没有发现PERV感染的证据。在一项回顾性临床调查中,160例接受猪组织治疗的病人体内没有发现PERV感染的证据。21例接受猪胰腺移植长达4.6-8年的患者体内也没有发现PERV感染的存在。但是,猪-人异种器官移植引起PERV感染人,甚至导致新的感染性疾病的可能性还不能被排除。由于清晰的遗传背景和细微的个体差异,中国小型猪成为猪-人异种移植可能的器官供体来源。中国实验用小型猪是中国小型猪的一种,由于具有体重适宜、抗病性强、遗传背景清晰、生理生化指标稳定等优点,使其成为异种移植的较好供体来源。近年的一项研究表明,在用以中国实验用小型猪肝细胞为材料的生物人工肝治疗的3例病人的血清中均未发现PERV转录酶活性。我们知道,猪携带的PERV拷贝数的多少可以作为该猪种是否适合用于异种移植和潜在种间病毒感染风险大小的重要依据。目前,在所检测的多种猪种中都存在多重PERV拷贝；不同猪种之间,甚至同一猪种的不同个体之间,PERV拷贝数存在明显差异。由于病毒的传播以其在宿主细胞内的表达为前提,所以PERV的表达情况也直接影响其感染风险大小。然而,有关中国实验用小型猪PERV亚型、拷贝数及其在mRNA水平的表达情况非常有限。本研究拟对中国实验用小型猪的PERV进行流行病学调查,从而为中国实验用小型猪的选择性育种提供必要的数据,为临床异种移植积累基础资料；并对PERV体外感染人源细胞进行检测,进一步认识PERV对人源细胞易感情况的范围,为临床猪替代品的应用提供一定的生物安全性评价。第一章中国实验用小型猪内源性逆转录病毒的调查研究目的通过调查中国实验用小型猪中PERV的流行病学情况,为对其选择性育种提供必要的依据,为临床异种移植积累基础资料。方法以中国实验用小型猪为研究对象,随机采集20头健康的中国实验用小型猪的耳组织,分别提取细胞DNA和：nRNA。我们设计并合成用于检测PERV亚型的三对引物(env-A、env-B和env-C),以PK15细胞基因组DNA作为阳性对照,以双蒸水为阴性对照,用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)方法检测中国实验用小型猪基因组DNA中PERV亚型。同时,我们以猪的持家基因转铁蛋白受体(TFRC)基因作为内参照,并选择PERV基因中保守性较强的pol区段设计并合成引物,依据构建的标准品质粒来做出标准曲线,用Real-Time Quantitative PCR的方法检测中国实验用小型猪细胞中PERV基因拷贝数,用Real-Time Quantitative RT-PCR的方法检测中国实验用小型猪细胞中PERV基因转录水平。结果①应用PCR的方法对中国实验用小型猪的PERV基因亚型进行检测,结果在所检测的20个不同猪个体的样本基因组DNA中,都发现了PERV基因,所检测的猪个体大部分为PERV-A/B混合型,少数为PERV-A/B/C混合型。②应用Real-Time Quantitative PCR的方法对中国实验用小型猪的PERV基因进行检测,在所检测的20个样本中,都检测到了PERV基因的存在,中国实验用小型猪细胞中PERV基因拷贝数分布在3.95±0.33(基因拷贝数/细胞)至95.524±1.42(基因拷贝数/细胞)之间。③应用Real-Time Quantitative RT-PCR的方法来检测中国实验用小型猪中PERV基因的转录(mRNA)水平,即PERV cDNA的拷贝数,在所检测的20个中国实验用小型猪样本中,都检测到了PERV基因的转录产物,中国实验用小型猪细胞PERV cDNA的拷贝数分布在3.66±0.33(cDNA拷贝数/细胞)至43.03±1.62(cDNA拷贝数/细胞)之间。结论所检测的中国实验用小型猪基因组内普遍存在PERV基因序列,主要是PERV-A/B混合型,并且PERV基因拷贝数及其转录水平参差不齐,存在PERV基因拷贝数和转录水平较低的个体,有希望通过对其选择性性育种或基因敲除等技术获得更低PERV拷贝数甚至无PERV的个体,因此,中国实验用小型猪是可能用于人类异种移植的供体源。第二章体外人源细胞对猪内源性逆转录病毒易感性的初步研究目的通过对PERV在体外感染人源细胞情况的检测,研究四种人源细胞对PERV的易感性。方法用PERV病毒上清感染培养中的四种人源细胞,以PK15细胞作为阳性对照,以相应的未感染细胞作为阴性对照,分别提取细胞DNA和总RNA,用PCR和RT-PCR方法研究PERV对这四种人源细胞的感染情况；提取细胞蛋白,以P15E抗原蛋白为参照,用Western blot方法检测感染组细胞中PERV基因在蛋白水平的表达情况。结果HEK293细胞对PERV易感,并且整合入HEK293细胞基因组中的PERV前病毒DNA是一个活化的基因,可以在RNA和蛋白水平表达；在LX-2细胞、HL-7702细胞和人原代肝细胞对PERV不易感。结论在体外,不同组织来源的人源细胞对PERV的易感性是不同的,人肝脏来源的细胞对PERV不易感。