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慢性牙周炎是一种常见的口腔疾病,主要表现为牙龈的炎症、牙周组织的破坏,最终导致牙齿松动,甚至脱落。目前牙周炎常规治疗方法虽可阻止病变的加重,但对破坏吸收的牙槽骨的修复再生问题还无法彻底解决。基于干细胞的组织再生方法是一种新型的牙周治疗方法,可使吸收的牙槽骨组织得以再生修复,以稳定牙齿或植入物,从而在根本上解决牙槽骨吸收的问题。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）具有成骨向分化的能力,是牙周组织再生理想的种子细胞,但是PDLSCs的成骨分化能力在炎症环境中会受到抑制。因此,如何改善炎症对PDLSCs的不良影响成为迫切需要解决的问题。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是革兰氏阴性细菌独有的一类高度活性的致病物质,在牙周炎的进展过程中起着非常重要的作用。研究发现,牙龈龈沟液中LPS的含量越高,牙周组织的炎症越重,即牙龈龈沟液中LPS的含量与牙周组织炎症程度有较强的正相关关系,且LPS可引起牙周局部的变态反应,如:激活单核细胞产生细胞因子,激活补体释放过敏介质等,从而造成牙周组织的破坏。除此之外,研究表明LPS可在体外抑制PDLSCs的成骨分化。因此,本研究选用适宜浓度的LPS在体外刺激PDLSCs,以在体外模拟炎症微环境。艾塞那肽（Exendin-4,Ex-4）是胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）的类似物,是一种应用于临床的新型降糖药。Ex-4可以抑制胰高血糖素的分泌和刺激胰岛素的分泌,增强胰岛β细胞的增殖和分化能力。研究发现Ex-4还具有促成骨和抗炎的作用。然而,Ex-4在炎症环境下对PDLSCs的增殖及成骨分化的调节作用目前尚不清楚。本研究用脂多糖（LPS）体外模拟炎症微环境,探究在炎症微环境下,Ex-4对PDLSCs的增殖及成骨分化能力的影响,并对其机制进行初步研究,为慢性牙周炎患者的牙周组织修复再生提供理论支持与实验依据。实验分成以下四个部分:第一部分:牙周膜干细胞的原代培养及鉴定目的:从离体牙的牙周膜组织中分离、培养PDLSCs,对其表型标志及多向分化能力等生物学特性进行鉴定,为下一步研究Ex-4在炎症微环境下对PDLSCs增殖和成骨分化的影响奠定基础。方法:采用组织块酶消化法分离培养PDLSCs;采用结晶紫染色法检测细胞克隆形成能力;茜素红染色法检测细胞成骨分化能力;油红O染色法检测细胞成脂分化能力;免疫荧光双染法对细胞表面是否表达干细胞表型分子标记STRO-1和CD146进行鉴定。结果:经组织块酶消化法培养5-8天后PDLSCs从组织块中爬出,结晶紫染色可见细胞接种后贴壁成活并形成集落,成骨诱导21天后茜素红染色可见矿化结节生成,成脂诱导14天后油红O染色可见脂滴生成。间充质干细胞表型分子标记STRO-1和CD146免疫荧光染色为阳性。结论:组织块酶消化法可成功培养出PDLSCs,培养的细胞具有较强的克隆形成能力,可成骨向分化和成脂向分化,细胞表面表达间充质干细胞表型分子标记STRO-1和CD146,可用于后续实验。第二部分:Exendin-4在炎症微环境下对牙周膜干细胞增殖和成骨分化能力的影响目的:探究Ex-4在LPS体外模拟炎症微环境下对PDLSCs增殖和成骨分化能力的影响。方法:1.采用不同浓度的LPS体外模拟炎症微环境,检测其对PDLSCs增殖的影响,分组如下:N1（空白对照组）,0.1μg/ml LPS,1μg/ml LPS,10μg/ml LPS,100μg/ml LPS。取第3代PDLSCs按上述分组,在除空白对照组以外的各组普通培养基中加入不同浓度LPS培养7天,CCK-8法检测第1,3,5,7天细胞的增殖能力。2.选取10μg/ml LPS模拟炎症微环境,检测加入不同浓度的Ex-4在炎症微环境下对PDLSCs增殖的影响,分组如下:N1（空白对照组）,LE1（1 nmol/l）,LE2（10 nmol/l）,LE3（50 nmol/l）,LE4（100 nmol/l）。取第3代PDLSCs按上述分组,在除空白对照组以外的各组普通培养基中加入10μg/ml LPS和不同浓度的Ex-4（1 nmol/l,10 nmol/l,50nmol/l,100 nmol/l）培养7天,采用CCK-8法检测第1,3,5,7天细胞增殖能力。3.选取10 nmol/l Ex-4作用PDLSCs,检测Ex-4在炎性微环境下对PDLSCs成骨分化的影响,分组如下:N2（成骨对照组）,Ex-4（10nmol/l）组,LPS（10μg/ml）组,LPS（10μg/ml）+Ex-4（10 nmol/l）组。取第3-5代PDLSCs按上述分组,在除成骨对照组以外的各组成骨诱导培养基中加入10μg/ml LPS或（和）10 nmol/l Ex-4培养21天,采用茜素红染色法检测矿化结节形成能力,实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测成骨分化相关基因（Runx2,ALP,Osx）的表达。结果:1.细胞培养第3天时,10μg/ml LPS组和100μg/ml LPS组的PDLSCs增殖能力与空白对照组（N1）比较均有显著增加（差异具有统计学意义（P<0.05））,其余剂量组细胞增殖能力与空白对照组比较无明显差异。细胞培养第5天时,100μg/ml LPS组增殖能力与空白对照组相比增高（差异具有统计学意义（P<0.05））,其余剂量组细胞增殖能力与空白对照组相比无明显差异。细胞培养第7天时,所有剂量组细胞增殖能力与空白对照组相比降低,但100μg/ml LPS组降低最显著（差异具有统计学意义（P<0.05））。2.与空白对照组（N1）相比,10μg/ml LPS+不同浓度的Ex-4（1nmol/l,10 nmol/l,50 nmol/l,100 nmol/l）在第3、5、7天对PDLSCs的增殖无显著差异（P>0.05）。其中LE2（10 nmol/l）组细胞增殖能力与除空白对照组以外的其余各组相比较高,但差异无统计学意义（P>0.05）。3.茜素红染色结果显示,与成骨对照组相比,在第21天时,Ex-4组形成的矿化结节显著增加,LPS组则显著减少,而与LPS组相比,LPS+Ex-4组的PDLSCs形成的矿化结节显著增加。RT-PCR结果显示,在第14天时,与成骨对照组相比,LPS组Runx2,ALP,Osx的表达降低;与LPS组相比,LPS+Ex-4组Runx2,ALP,Osx的表达显著增加。差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:10μg/ml LPS在早期促进PDLSCs的增殖能力,在晚期抑制PDLSCs的增殖能力;10μg/ml LPS还可抑制PDLSCs的成骨分化能力。Ex-4可使炎症微环境下PDLSCs的增殖恢复正常,并可促进炎症微环境下PDLSCs的成骨分化。第三部分:Exendin-4在炎症微环境下对牙周膜干细胞NF-κB信号通路的影响目的:探究Ex-4在炎症微环境下是否通过NF-κB信号通路对PDLSCs起抗炎作用。方法:分组:N1（空白对照组）,Ex-4（10 nmol/l）组,LPS（10μg/ml）组,LPS（10μg/ml）+Ex-4（10nmol/l）组。取第3-5代PDLSCs按上述分组,在除空白对照组以外的各组普通培养基中加入10μg/ml LPS或（和）10 nmol/l Ex-4培养24h,RT-PCR检测TNF-α和IL-6基因表达;免疫印迹实验（Western Blot）检测TNF-α、IL-6、IκBα和p-IκBα蛋白表达;酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清液中TNF-α和IL-6蛋白表达情况;免疫荧光单染法检测NF-κB/p65在细胞核与细胞质中的表达变化情况。结果:与空白对照组（N1）比较,TNF-α和IL-6基因和蛋白的表达在Ex-4组无明显变化,在LPS组显著升高;与LPS组比较,其在LPS+Ex-4组表达显著下降。与空白对照组（N1）比较,LPS组p-IκBα和IκBα的表达均显著增加,而在Ex-4组中p-IκBα和IκBα表达均显著降低;与LPS组比较,LPS+Ex-4组中p-IκBα和IκBα表达均显著降低。差异均具有统计学意义（P<0.05）。此外,免疫荧光结果表明,在空白对照组（N1）中,NF-κB/p65复合物位于细胞质中;在Ex-4组中,该复合物位于细胞质中;而在LPS组中,该复合物易位至细胞核;在LPS+Ex-4组中,该复合物定位于细胞质中。结论:Ex-4在炎症微环境下可通过抑制NF-κB信号通路对PDLSCs起抗炎作用。第四部分:Exendin-4在炎症微环境下对牙周膜干细胞Wnt信号通路的影响目的:探究Ex-4在炎症微环境下是否通过Wnt信号通路对PDLSCs起促成骨分化的作用。方法:分组:N2（成骨对照组）,Ex-4（10 nmol/l）组,LPS（10μg/ml）组,LPS（10μg/ml）+Ex-4（10 nmol/l）组。取第3-5代PDLSCs按上述分组,在除成骨对照组以外的各组成骨诱导培养基中加入10μg/ml LPS或（和）10 nmol/l Ex-4培养7天。采用Western Blot检测Runx2,β-catenin,GSK-3β和p-GSK-3β蛋白的表达情况。结果:与成骨对照组（N2）相比,Ex-4组中β-catenin蛋白表达在细胞浆与细胞核中表达均增高;LPS组中β-catenin蛋白表达在细胞核中显著升高,而在胞质中表达降低;与LPS组相比,LPS+Ex-4组细胞核中的β-catenin的表达显著降低,在胞质中表达显著升高。与成骨对照组（N2）相比,在Ex-4组中p-GSK-3β显著降低,而总GSK-3β的表达增加;LPS组中p-GSK-3β表达显著增高,总GSK-3β的表达显著降低;与LPS组相比,LPS+Ex-4组总GSK-3β表达增加,p-GSK-3β表达降低。与成骨对照组（N2）相比,Ex-4组Runx2表达显著增加;LPS组Runx2表达显著降低;与LPS组对比,LPS+Ex-4组Runx2表达显著升高。差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:Ex-4在炎症微环境下可通过调节Wnt信号通路来促进PDLSCs成骨分化。