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背景肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）相关的凋亡诱导配体（TNF-relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL）是肿瘤坏死因子超家族成员之一，是近年来肿瘤治疗的主要研究目标之一。TRAIL在细胞内有五种受体：死亡受体（Death Receptor，DR）4、5，诱骗受体DcR1，DcR2和OPG。DR4、DR5上有Fas相关的死亡结构域（Fas-associatedprotein with death domain，FADD），通过结合procaspase-8和-10形成死亡诱导信号复合体（death-inducing signalling complex，DISC），诱导它们的裂解和激活，继而激活下游的caspases，诱导肿瘤细胞凋亡。本实验室已利用人DR5蛋白免疫小鼠制备出抗DR5的单克隆抗体-YM366EC，本实验室通过PCR技术钓取抗体可变区基因并得到了单链抗体scFv（3D）和四价抗体（3S），经研究发现四价抗体对肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用。3S是由单链抗体基因与P53基因融合，P53可以自动聚合成四聚体，从而聚合得到四价抗体。本实验将二价抗体通过二硫键及α超螺旋结构聚合，获得了正向四价和反向四价抗体，分别命名为3ZS、3FS。此外，本实验在选择表达系统时，改用了毕赤酵母体系表达抗体蛋白。目前毕赤酵母表达蛋白多采用甲醇诱导型表达，在发酵过程添加甲醇作为碳源诱导蛋白表达。由于甲醇有毒性，易挥发，易燃，操作过程有一定危险性，本实验选择组成型表达：以pGAPZαC作为表达载体，该载体由GAP启动子启动外源基因表达，以葡萄糖作为碳源。该表达体系较真核细胞表达体系，成本低，抗体产量高，培养周期短；较原核细胞表达体系，可以更好的进行蛋白翻译后修饰。目的在毕赤酵母重组表达YM366EC单链抗体及多价抗体。方法运用PCR技术，以质粒pSegtag2A-3D、pSegtag2A-3S为模板，扩增可以连接至毕赤酵母表达载体pGAPZαC的3D、3S基因片段，应用重叠延伸PCR技术,扩增正向四价和反向四价抗体基因序列，即VL-VH-HSA-VL-VH-IgG hinge-dhlx和VL-VH-HSA-VH-VL-IgG hinge–dhlx，分别命名为3ZS，3FS。然后用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ酶切载体pGAPZαC与目的基因片段3D、3S、3ZS、3FS，并分别连接到毕赤酵母表达载体pGAPZαC中，得到重组表达载体pGAPZαC-3D，pGAPZαC-3S，pGAPZαC-3ZS，pGAPZαC-3FS，测序正确后电转化至毕赤酵母GS115中，并以此用博来霉素（zeocin）筛选阳性克隆后，用菌液PCR方法验证目的基因是否转化成功，用Western blot验证目的蛋白能否成功表达，然后扩大培养阳性克隆，将得到的培养上清经Ni2+-NTA superflow亲和柱纯化得到目的蛋白。同时采用PCR技术从pcDNA3.1-DR5中扩增得到人源DR5基因片段，用限制性内切酶BamHI和HindIII的酶切位点连接大肠杆菌表达载体PET-30a和DR5基因片段，得到PET-30a-DR5,测序正确后，转化至E.coliBL21，用0.1mmol/L IPTG诱导表达DR5，并用Ni2+-NTA supeflow亲和柱纯化。然后以该DR5包被ELISA板，检测抗体的亲和性。结果成功扩增单链、四价、正向四价抗体和反向四价抗体基因序列，构建了毕赤酵母表达载体pGAPZαC-3D，pGAPZαC-3S，pGAPZαC-3ZS，pGAPZαC-3FS，并成功在毕赤酵母GS115中表达了目的蛋白；Western blot实验证明：p-3D、p-3S、p-3ZS、p-3FS质粒表达产物中分别含有约41.3KD、46.9KD、72.4KD、72.4KD大小的特异性蛋白条带，ELISA测定抗体亲和性，证明3S亲和性最高，其次是3ZS、3FS，3D亲和性最低。结论抗DR5多价抗体亲和性较单链抗体更高：3S亲和性最高，其次是3ZS、3FS，3D亲和性最低。