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目的:研究肠胃清口服液抑制乏氧结肠癌细胞浸润、转移的效果,并对其调控机制进行初步地探讨,为中医扶正祛邪法治疗结直肠癌、防治结直肠癌浸润转移提供实验依据。
方法:(1)用血清药理学方法制备肠胃清药物血清。(2)根据Hideko Nagasawa等文中所述,改良设计乏氧培养箱,注入5%CO<,2>和95% N<,2>以达到培养箱中的乏氧环境。(3)通过体外MTT细胞毒性实验,检测肠胃清药物血清对癌细胞增殖能力的影响。(4)通过建立“创伤”实验模型(Wound Model)和培养小室模型(Chamber Model),在体外测定和评价肠胃清药物血清抗癌细胞浸润转移的能力。(5)通过建立细胞粘附模型(Cell Adhesion Model)定量测定肠胃清药物血清对癌细胞异质粘附能力的影响。(6)建立明胶酶谱模型(Gelatin Zymography Model),分析肠胃清药物血清对细胞外基质降解酶基质金属蛋白酶-2,-9(maqtrix metalloproteinase-2,-9, MMP-2,-9)的影响。(7)进一步采用Western-blot方法分析肠胃清药物血清对核转录因子乏氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)细胞核内蛋白量变化的影响。采用RT-PCR方法研究肠胃清药物血清对MMP-9、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA水平的影响。
结果:(1)通过MTT实验结果,选择10%以内的药物血清浓度,作用于人结肠癌LoVo细胞,研究肠胃清抑制乏氧结肠癌细胞体外转移的作用。(2)在“创伤”实验(Wound Healing Assay)中,10%肠胃清药物血清在常氧培养条件下对LoVo细胞移动能力的抑制率达到29.87%,在乏氧培养条件下对LoVo细胞移动能力的抑制率达到68.00%,P<0.001,表明肠胃清药物血清在乏氧培养条件下对LoVo细胞移动能力的抑制作用与在常氧培养条件下相比更为显著。(3)在浸润杯实验(Cell Invasion Assay)中,肠胃清药物血清(0%、1.25%、2.5%、5%、10%)在常氧、乏氧培养条件下均呈剂量依赖性的方式抑制LoVo细胞的浸润能力;10%肠胃清药物血清在常氧培养条件下对LOVo细胞浸润能力的抑制率达到32.21%,在乏氧培养条件下对LoVo细胞浸润能力的抑制率达到36.81%,P>0.05,表明肠胃清药物血清在乏氧培养条件下对LoVo细胞浸润能力的抑制作用与在常氧培养条件下相比有一定差异。(4)在细胞粘附实验(cell Adhesion Assay)中,肠胃清药物血清(0%、1.25%、2.5%、5%、10%)在常氧和乏氧培养条件下均呈浓度依赖性显著抑制结肠癌细胞粘附到人工重组基底膜胶(Matrigel);10%肠胃清药物血清在常氧培养条件下对LoVo细胞粘附能力的抑制率达到31.93%,在乏氧培养条件下对LoVo细胞粘附能力的抑制率达到40.00%,P<0.01,表明肠胃清药物血清在乏氧培养条件下对LoVo细胞粘附能力的抑制作用与在常氧培养条件下相比作用显著。(5)明胶酶谱实验(Gelatinase Zymogram)结果显示,肠胃清药物血清呈剂量依赖性地抑制乏氧结肠癌细胞分泌的转移相关酶MMP-2,-9的活性。(6)通过Western-blot和RT-PCR方法,在乏氧培养条件下,肠胃清药物血清(0%、2.5%、10%)呈剂量依赖性的方式抑制HIF-1α进入细胞核以及MMP-9、VEGF mRNA的表达。
结论:上述研究表明,肠胃清能够抑制乏氧结肠癌细胞的移动能力、浸润能力、总粘附能力和MMP-2,-9的活性,从而提示,肠胃清具有有效地抑制结肠癌癌细胞体外转移的作用。其机理与肠胃清可以通过抑制乏氧结肠癌细胞内HIF-1α的活化,进而下调MMP-9,VEGFmRNA的表达,发挥其抑制癌转移的作用有关。