脂肪酶（lipase, EC3.1.1.3），全称三酰甘油酰基水解酶，广泛存在于生物体内。脂肪酶底物是甘油酯类，水解位点是甘油和12个碳原子以上不溶性长链脂肪酸所形成的酯键，能够分解生物产生的各类天然油和脂肪。作为一种界面酶，脂肪酶的水解反应只发生在油-水界面上，即水溶性的酶在水不溶的底物和水的界面上催化反应。微生物来源的脂肪酶由于作用多样、易于培养、产量丰富等特点而被广泛用于工业生产，其中热稳定脂肪酶的研究和开发更是具有重要的商业价值。本实验室一直从事嗜热真菌产酶的研究，分离到了疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyceslanuginosus），它分布广泛，生长上限较高，产生的脂肪酶具有较高的工业价值。本实验的研究对象是实验室之前克隆得到的疏绵状嗜热丝孢菌（T. lanuginosus）脂肪酶基因lgy（GenBank登录号为EU370914），将其和酵母表达载体pPIC9K双酶切后用T4连接酶进行体外连接，构建酵母重组表达载体pPIC9K/lgy，测序以保证正确的阅读框。将重组表达质粒pPIC9K/lgy用SacⅠ（位于5’AOX1区内）线性化后转入巴斯德毕赤酵母，经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子得到工程菌GS-LGY-1，进行甲醇诱导培养，纯化蛋白并测定酶活。甲醇诱导6d后酶活性达到最高7.453U/mg。利用定向进化的方法对疏绵状嗜热丝孢菌（T. lanuginosus）脂肪酶LGY进行分子改造。采用易错PCR方法，建立了含有14755个转化子的突变体库。以高活力为筛选压力，通过三丁酸甘油酯平板透明圈法、G418平板、小量发酵筛选和大量发酵测酶活，最后确定一株正向突变菌株MLGY18-126，对此工程菌进行发酵，通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等步骤纯化了突变蛋白并测定酶活，结果其酶活是野生菌株所产酶活力的2.3倍。对此突变基因进行测得的序列，并与野生基因比较，有3个碱基位点发生变化，其中两个位点引起氨基酸的变化，它们是G96V，A192V。以酵母工程菌株GS-LGY-1为出发菌，对定向进化突变体中引起氨基酸突变的两个突变碱基位点进行定点突变，构建表达载体后转入毕赤酵母GS115，得到两个定点突变工程菌G96VLGY、A192VLGY。分别进行蛋白表达并测定酶活，结果定点突变工程菌G96VLGY所产酶活力和定向进化工程菌MLGY18-126基本相同，都比野生工程菌GS-LGY-1高，而定点突变工程菌A192VLGY所产酶活力同野生菌GS-LGY-1基本相同，可以初步认为定向进化得到的酶活提高的工程菌MLGY18-126中起作用的突变位点是第96位，氨基酸由甘氨酸（Gly）变为缬氨酸（Val）。通过简要分析LGY表达蛋白的三级结构，初步认为第96位氨基酸是由一个亲水性氨基酸变为疏水性氨基酸，因此增强了酶与底物之间的疏水性接触，增强和底物的结合能力，可能引起酶活性的提高。