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背景：
在科学技术异常发达的当下，恶性肿瘤依旧是威胁着人类生命和健康的一大杀手，而肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，也是我国发病率、死亡率最高的肿瘤。放疗作为肿瘤常用且有效的治疗手段，在肺癌治疗中的地位举足轻重，然而患者的长期生存率仍有待提高。并且不同的患者对放疗的敏感性存在个体差异，甚至有部分患者在治疗的过程中出现放疗抵抗。因此，研究肺癌放疗过程中的分子变化，并分析其与放疗疗效的关系，有助于发现新的治疗靶点，改善肺癌患者的预后。
放疗可以通过引起细胞周期阻滞、促进细胞凋亡及改变肿瘤微环境等方式消除肿瘤细胞，放疗后的DNA双链断裂，被认为是主要的致死性损伤。然而，细胞中存在修复损伤的机制，如同源重组修复、非同源末端连接等，正是肿瘤细胞的这种自我修复能力介导了放疗抵抗。既往研究多集中在与损伤修复相关的蛋白质，近年来非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)在DNA损伤中的作用逐渐成为新的研究热点之一。长链非编码RNA(long non-coding RNA ， lncRNA)作为非编码RNA的重要一员，是指长度大于200个核苷酸，并且不编码蛋白质的RNA。研究表明lncRNA参与多种生物学过程，在肿瘤的发生、发展中也扮演着重要的角色，可以影响肿瘤细胞的恶性表型。并且，越来越多的研究认为功能性lncRNA是潜在的诊断、判断预后的分子标志物，甚至有望成为新的治疗靶标。近年来随着测序技术的飞速发展，人们发现了大量的lncRNA，但大部分lncRNA的功能尚有待探索。已经有报道部分lncRNA可以影响肿瘤细胞的放疗敏感性，但这些研究多集中在生殖系统和消化系统肿瘤，lncRNA在肺癌放疗方面的研究甚少。
LncRNA作为调节分子，在细胞内发挥作用的机制主要有诱导分子、支架分子、信号分子及引导分子，它可以在转录水平、转录后水平及表观遗传学方面调节基因的表达。而lncRNA的作用机制通常与它在细胞内的定位相关，细胞核内的lncRNA可以与转录因子或RNA聚合酶等结合调控基因的表达，也可以通过调控DNA或组蛋白的表观遗传修饰影响基因的表达。细胞质内的lncRNA可以通过与miRNA相互作用、调控信使RNA(messager RNA，mRNA)的稳定性及影响蛋白质翻译等方式参与基因的调控。研究lncRNA在肺癌放疗中的变化，明确它在肺癌细胞中的功能，并探索它发挥作用的机制，可以为肿瘤治疗提供新的思路，具有一定的临床应用价值。
本文分为以下三个部分。
第一部分：肺癌细胞放射照射后lncRNA的变化
目的：
探索肺癌细胞放射照射后lncRNA的改变，并确定与肺癌密切相关的lncRNA，为后续研究打下坚实的理论和实验基础。
方法：
1.采用X-Rad225辐照仪，使人源肺癌细胞系A549、H460、H1975、H1299接受不同剂量照射(0Gy、1Gy、2Gy、3Gy、4Gy、5Gy、6Gy)，照射后通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)检测细胞存活情况，分析半数致死照射剂量。
2.采用半数致死剂量对肺癌细胞系A549、H460、H1975、H1299进行照射，并于照射后不同时间点(0、15min、30min、1h、3h、5h、8h、12h、24h)收集细胞提取蛋白，通过westernblot检测蛋白γ-H2AX在照射后不同时间点的变化。
3.肺癌细胞系A549、H460接受半数致死剂量照射，在γ-H2AX含量最高的时间点收集细胞于Trizol中，提取RNA后，行RNA测序(RNA-Sequence， RNA-Seq)分析。
4.通过实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)在细胞水平验证RNA-Seq结果，初步筛选目标lncRNA。
5.收集30例肺癌患者手术后组织标本，研磨组织提取RNA，并逆转录成cDNA。用RT-qPCR检测癌组织和癌旁组织内ncRNA的相对表达水平，筛选出目标lncRNA。
6.检测目标lncRNA在H1975和H1299细胞中照射后的变化情况。
7.统计分析与做图分别采用SPSS20.0统计软件包、GraphPadPrism7.0。两组间比较采用t检验，其中配对样本资料采用配对t检验或Wilcoxon(W)检验，独立样本资料采用独立样本t检验或Mann-WhitneyU检验，P＜0.05认为具有统计学意义。
结果：
1.肺癌细胞A549、H460的半数致死照射剂量分别是4.906Gy、4.187Gy，均在照射后30min蛋白γ-H2AX的含量达到高峰。H1975、H1299的半数致死照射剂量分别为1.749Gy、1.529Gy，且在照射后1hγ-H2AX升高最显著。
2.A549和H460照射组与对照组均行RNA-seq检测，结果显示A549细胞照射后共922个lncRNA上调，879个下调(P＜0.05)，H460细胞照射后上调407个，下调344个(P＜0.05)。两细胞系结果取交集以后，23个相同的lncRNA上调，11个相同的lncRNA下调。
3.A549和H460细胞照射后变化一致，且与RNA-seq结果相符的ncRNAs分别是：SNORD3A、RP11-1275H24.1、lnc-RHEBL1-1、lnc-KIAA0753-1、lncLCIR-1。
4.SNORD3A、lnc-RHEBL1-1在肺癌患者癌组织与癌旁组织的相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。RP11-1275H24.1在癌组织中相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P=0.002)。Lnc-KIAA0753-1在癌组织中相对表达量低于癌旁组织，差异有统计学意义(P=0.017)。LncLCIR-1在癌组织中相对表达量高于癌旁组织，且差异有统计学意义(P=0.002)。
5.H1975和H1299细胞照射后1h检测lncLCIR-1的表达量，同样表现为下调。
结论：
LncLCIR-1在肺癌组织内相对表达量最稳定，且明显高于癌旁组织，表明该lncRNA在肺癌的发生、发展中可能发挥了重要作用。LncLCIR-1在肺癌细胞放射照射后表达量下降，提示其可能与放疗疗效相关。
第二部分：LncLCIR-1在肺癌细胞中的功能研究
目的：
改变肺癌细胞lncLCIR-1的表达量后，通过体内、体外实验，探索lncLCIR-1对肺癌细胞增殖、侵袭、周期、凋亡及放疗敏感性的影响。
方法：
1.采用RT-qPCR技术，检测A549、H460、H1299及H1975细胞中lncLCIR-1的本底表达水平。
2.通过RNA干扰技术和过表达载体质粒进行瞬时转染细胞，用平板克隆形成实验、细胞计数实验探索lncLCIR-1对细胞增殖的影响。
3.敲低或过表达lncLCIR-1后，检测细胞侵袭能力、细胞周期及细胞凋亡的变化。
4.通过细胞凋亡、克隆形成实验，探索lncLCIR-1对肺癌细胞放疗敏感性的影响。
5.裸鼠荷瘤实验检测lncLCIR-1对皮下移植瘤的影响。
6.分别用SPSS20.0统计软件包、GraphPadPrism7.0进行统计分析和做图。两组间比较采用t检验，P＜0.05代表差异有统计学意义。
结果：
1.LncLCIR-1在H1299细胞内相对高表达，在H1975细胞内相对低表达，A549和H460细胞的表达量处于中间水平。
2.平板克隆形成实验与细胞计数实验均表明：敲低lncLCIR-1可以抑制细胞增殖，过表达lncLCIR-1可以促进细胞增殖。
3.敲低lncLCIR-1降低细胞侵袭能力，过表达lncLCIR-1增加肺癌细胞侵袭能力。
4.敲低lncLCIR-1引起细胞G1期比例增加，S期比例减少。过表达lncLCIR-1使细胞G1期比例减少，S期比例增加。
5.敲低lncLCIR-1促进肺癌细胞凋亡，并与放疗发挥协同作用，共同促进肺癌细胞凋亡。
6.敲低lncLCIR-1后，肺癌细胞放疗敏感性增加。
7.敲低lncLCIR-1后，抑制皮下移植瘤的生长。
结论：
LncLCIR-1可以促进肺癌细胞的增殖、侵袭，敲低lncLCIR-1可以引起细胞G1期阻滞、促进细胞凋亡、增加放疗敏感性，且敲低lncLCIR-1可以抑制皮下移植瘤生长。表明该lncRNA在肿瘤中发挥癌基因的作用，靶向该lncRNA，可以抑制肿瘤的恶性生物学行为。
第三部分：LncLCIR-1通过调控KDM5A基因启动子区DNA甲基化水平影响肺癌细胞生物学功能
目的：
研究lncLCIR-1促进肺癌恶性生物学功能的下游基因，并探索调控下游基因的作用机制。
方法：
1.在不同细胞系内通过核质分离实验，分析lncLCIR-1的核质分布情况。
2.利用在线数据库，分析lncLCIR-1与邻近基因KDM5A的相关性。
3.改变lncLCIR-1表达水平后，通过RT-qPCR、westerrnblot检测mRNA水平和蛋白水平KDM5A的变化。
4.在不同细胞内将KDM5A基因敲低或过表达，观察肿瘤细胞生物学行为的改变。
5.通过慢病毒转染细胞，构建lncLCIR-1过表达稳转细胞系。
6.将lncLCIR-1敲低或过表达后，通过质谱法分析DNA甲基化的改变，研究KDM5A基因启动子区DNA甲基化的变化情况。
7.利用在线预测工具，分析lncLCIR-1与DNA去甲基化酶的相互作用。
8.用RNA-pulldown和RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation，RIP)实验验证lncLCIR-1与DNA去甲基化酶的相互作用关系。
9.结果的统计分析应用SPSS20.0统计软件包，运用GraphPadPrism7.0进行做图。相关性采用Pearson’s相关性分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05代表差异具有统计学意义。
结果：
1.核质分离实验表明lncLCIR-1在A549、H460及H1299细胞内均定位于细胞核内。
2.在线预测表明lncLCIR-1与邻近基因KDM5A的表达存在正相关。
3.在A549、H460及H1299细胞内敲低lncLCIR-1后，KDM5A在mRNA和蛋白水平的表达均下调。
4.KDM5A在A549和H460细胞中发挥癌基因的作用。
5.慢病毒转染可以成功构建稳转细胞系。
6.A549细胞内敲低lncLCIR-1后，KDM5A基因启动子区DNA的甲基化水平增高。反之，过表达lncLCIR-1后，KDM5A基因启动子区DNA甲基化水平降低。
7.在线预测显示lncLCIR-1与DNA去甲基化酶存在相互作用。
8.RNA-pulldown和RIP实验均证实lncLCIR-1可以与DNA去甲基化酶TET1结合。
结论：
LncLCIR-1在不同的肺癌细胞系内均定位在细胞核内，可以调控下游癌基因KDM5A的表达。机制研究表明lncLCIR-1通过与DNA去甲基化酶TET1结合，调控KDM5A基因启动子区DNA甲基化水平，进而影响KDM5A的表达。
在科学技术异常发达的当下，恶性肿瘤依旧是威胁着人类生命和健康的一大杀手，而肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，也是我国发病率、死亡率最高的肿瘤。放疗作为肿瘤常用且有效的治疗手段，在肺癌治疗中的地位举足轻重，然而患者的长期生存率仍有待提高。并且不同的患者对放疗的敏感性存在个体差异，甚至有部分患者在治疗的过程中出现放疗抵抗。因此，研究肺癌放疗过程中的分子变化，并分析其与放疗疗效的关系，有助于发现新的治疗靶点，改善肺癌患者的预后。
放疗可以通过引起细胞周期阻滞、促进细胞凋亡及改变肿瘤微环境等方式消除肿瘤细胞，放疗后的DNA双链断裂，被认为是主要的致死性损伤。然而，细胞中存在修复损伤的机制，如同源重组修复、非同源末端连接等，正是肿瘤细胞的这种自我修复能力介导了放疗抵抗。既往研究多集中在与损伤修复相关的蛋白质，近年来非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)在DNA损伤中的作用逐渐成为新的研究热点之一。长链非编码RNA(long non-coding RNA ， lncRNA)作为非编码RNA的重要一员，是指长度大于200个核苷酸，并且不编码蛋白质的RNA。研究表明lncRNA参与多种生物学过程，在肿瘤的发生、发展中也扮演着重要的角色，可以影响肿瘤细胞的恶性表型。并且，越来越多的研究认为功能性lncRNA是潜在的诊断、判断预后的分子标志物，甚至有望成为新的治疗靶标。近年来随着测序技术的飞速发展，人们发现了大量的lncRNA，但大部分lncRNA的功能尚有待探索。已经有报道部分lncRNA可以影响肿瘤细胞的放疗敏感性，但这些研究多集中在生殖系统和消化系统肿瘤，lncRNA在肺癌放疗方面的研究甚少。
LncRNA作为调节分子，在细胞内发挥作用的机制主要有诱导分子、支架分子、信号分子及引导分子，它可以在转录水平、转录后水平及表观遗传学方面调节基因的表达。而lncRNA的作用机制通常与它在细胞内的定位相关，细胞核内的lncRNA可以与转录因子或RNA聚合酶等结合调控基因的表达，也可以通过调控DNA或组蛋白的表观遗传修饰影响基因的表达。细胞质内的lncRNA可以通过与miRNA相互作用、调控信使RNA(messager RNA，mRNA)的稳定性及影响蛋白质翻译等方式参与基因的调控。研究lncRNA在肺癌放疗中的变化，明确它在肺癌细胞中的功能，并探索它发挥作用的机制，可以为肿瘤治疗提供新的思路，具有一定的临床应用价值。
本文分为以下三个部分。
第一部分：肺癌细胞放射照射后lncRNA的变化
目的：
探索肺癌细胞放射照射后lncRNA的改变，并确定与肺癌密切相关的lncRNA，为后续研究打下坚实的理论和实验基础。
方法：
1.采用X-Rad225辐照仪，使人源肺癌细胞系A549、H460、H1975、H1299接受不同剂量照射(0Gy、1Gy、2Gy、3Gy、4Gy、5Gy、6Gy)，照射后通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)检测细胞存活情况，分析半数致死照射剂量。
2.采用半数致死剂量对肺癌细胞系A549、H460、H1975、H1299进行照射，并于照射后不同时间点(0、15min、30min、1h、3h、5h、8h、12h、24h)收集细胞提取蛋白，通过westernblot检测蛋白γ-H2AX在照射后不同时间点的变化。
3.肺癌细胞系A549、H460接受半数致死剂量照射，在γ-H2AX含量最高的时间点收集细胞于Trizol中，提取RNA后，行RNA测序(RNA-Sequence， RNA-Seq)分析。
4.通过实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)在细胞水平验证RNA-Seq结果，初步筛选目标lncRNA。
5.收集30例肺癌患者手术后组织标本，研磨组织提取RNA，并逆转录成cDNA。用RT-qPCR检测癌组织和癌旁组织内ncRNA的相对表达水平，筛选出目标lncRNA。
6.检测目标lncRNA在H1975和H1299细胞中照射后的变化情况。
7.统计分析与做图分别采用SPSS20.0统计软件包、GraphPadPrism7.0。两组间比较采用t检验，其中配对样本资料采用配对t检验或Wilcoxon(W)检验，独立样本资料采用独立样本t检验或Mann-WhitneyU检验，P＜0.05认为具有统计学意义。
结果：
1.肺癌细胞A549、H460的半数致死照射剂量分别是4.906Gy、4.187Gy，均在照射后30min蛋白γ-H2AX的含量达到高峰。H1975、H1299的半数致死照射剂量分别为1.749Gy、1.529Gy，且在照射后1hγ-H2AX升高最显著。
2.A549和H460照射组与对照组均行RNA-seq检测，结果显示A549细胞照射后共922个lncRNA上调，879个下调(P＜0.05)，H460细胞照射后上调407个，下调344个(P＜0.05)。两细胞系结果取交集以后，23个相同的lncRNA上调，11个相同的lncRNA下调。
3.A549和H460细胞照射后变化一致，且与RNA-seq结果相符的ncRNAs分别是：SNORD3A、RP11-1275H24.1、lnc-RHEBL1-1、lnc-KIAA0753-1、lncLCIR-1。
4.SNORD3A、lnc-RHEBL1-1在肺癌患者癌组织与癌旁组织的相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。RP11-1275H24.1在癌组织中相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P=0.002)。Lnc-KIAA0753-1在癌组织中相对表达量低于癌旁组织，差异有统计学意义(P=0.017)。LncLCIR-1在癌组织中相对表达量高于癌旁组织，且差异有统计学意义(P=0.002)。
5.H1975和H1299细胞照射后1h检测lncLCIR-1的表达量，同样表现为下调。
结论：
LncLCIR-1在肺癌组织内相对表达量最稳定，且明显高于癌旁组织，表明该lncRNA在肺癌的发生、发展中可能发挥了重要作用。LncLCIR-1在肺癌细胞放射照射后表达量下降，提示其可能与放疗疗效相关。
第二部分：LncLCIR-1在肺癌细胞中的功能研究
目的：
改变肺癌细胞lncLCIR-1的表达量后，通过体内、体外实验，探索lncLCIR-1对肺癌细胞增殖、侵袭、周期、凋亡及放疗敏感性的影响。
方法：
1.采用RT-qPCR技术，检测A549、H460、H1299及H1975细胞中lncLCIR-1的本底表达水平。
2.通过RNA干扰技术和过表达载体质粒进行瞬时转染细胞，用平板克隆形成实验、细胞计数实验探索lncLCIR-1对细胞增殖的影响。
3.敲低或过表达lncLCIR-1后，检测细胞侵袭能力、细胞周期及细胞凋亡的变化。
4.通过细胞凋亡、克隆形成实验，探索lncLCIR-1对肺癌细胞放疗敏感性的影响。
5.裸鼠荷瘤实验检测lncLCIR-1对皮下移植瘤的影响。
6.分别用SPSS20.0统计软件包、GraphPadPrism7.0进行统计分析和做图。两组间比较采用t检验，P＜0.05代表差异有统计学意义。
结果：
1.LncLCIR-1在H1299细胞内相对高表达，在H1975细胞内相对低表达，A549和H460细胞的表达量处于中间水平。
2.平板克隆形成实验与细胞计数实验均表明：敲低lncLCIR-1可以抑制细胞增殖，过表达lncLCIR-1可以促进细胞增殖。
3.敲低lncLCIR-1降低细胞侵袭能力，过表达lncLCIR-1增加肺癌细胞侵袭能力。
4.敲低lncLCIR-1引起细胞G1期比例增加，S期比例减少。过表达lncLCIR-1使细胞G1期比例减少，S期比例增加。
5.敲低lncLCIR-1促进肺癌细胞凋亡，并与放疗发挥协同作用，共同促进肺癌细胞凋亡。
6.敲低lncLCIR-1后，肺癌细胞放疗敏感性增加。
7.敲低lncLCIR-1后，抑制皮下移植瘤的生长。
结论：
LncLCIR-1可以促进肺癌细胞的增殖、侵袭，敲低lncLCIR-1可以引起细胞G1期阻滞、促进细胞凋亡、增加放疗敏感性，且敲低lncLCIR-1可以抑制皮下移植瘤生长。表明该lncRNA在肿瘤中发挥癌基因的作用，靶向该lncRNA，可以抑制肿瘤的恶性生物学行为。
第三部分：LncLCIR-1通过调控KDM5A基因启动子区DNA甲基化水平影响肺癌细胞生物学功能
目的：
研究lncLCIR-1促进肺癌恶性生物学功能的下游基因，并探索调控下游基因的作用机制。
方法：
1.在不同细胞系内通过核质分离实验，分析lncLCIR-1的核质分布情况。
2.利用在线数据库，分析lncLCIR-1与邻近基因KDM5A的相关性。
3.改变lncLCIR-1表达水平后，通过RT-qPCR、westerrnblot检测mRNA水平和蛋白水平KDM5A的变化。
4.在不同细胞内将KDM5A基因敲低或过表达，观察肿瘤细胞生物学行为的改变。
5.通过慢病毒转染细胞，构建lncLCIR-1过表达稳转细胞系。
6.将lncLCIR-1敲低或过表达后，通过质谱法分析DNA甲基化的改变，研究KDM5A基因启动子区DNA甲基化的变化情况。
7.利用在线预测工具，分析lncLCIR-1与DNA去甲基化酶的相互作用。
8.用RNA-pulldown和RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation，RIP)实验验证lncLCIR-1与DNA去甲基化酶的相互作用关系。
9.结果的统计分析应用SPSS20.0统计软件包，运用GraphPadPrism7.0进行做图。相关性采用Pearson’s相关性分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05代表差异具有统计学意义。
结果：
1.核质分离实验表明lncLCIR-1在A549、H460及H1299细胞内均定位于细胞核内。
2.在线预测表明lncLCIR-1与邻近基因KDM5A的表达存在正相关。
3.在A549、H460及H1299细胞内敲低lncLCIR-1后，KDM5A在mRNA和蛋白水平的表达均下调。
4.KDM5A在A549和H460细胞中发挥癌基因的作用。
5.慢病毒转染可以成功构建稳转细胞系。
6.A549细胞内敲低lncLCIR-1后，KDM5A基因启动子区DNA的甲基化水平增高。反之，过表达lncLCIR-1后，KDM5A基因启动子区DNA甲基化水平降低。
7.在线预测显示lncLCIR-1与DNA去甲基化酶存在相互作用。
8.RNA-pulldown和RIP实验均证实lncLCIR-1可以与DNA去甲基化酶TET1结合。
结论：
LncLCIR-1在不同的肺癌细胞系内均定位在细胞核内，可以调控下游癌基因KDM5A的表达。机制研究表明lncLCIR-1通过与DNA去甲基化酶TET1结合，调控KDM5A基因启动子区DNA甲基化水平，进而影响KDM5A的表达。