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α-淀粉酶作为最早进行商品化生产、应用最广泛、用量最大的酶制剂之一,在淀粉制糖及发酵工业中不可或缺。目前工业上广泛使用的商品化耐酸性高温α-淀粉酶最适pH 一般在5.0-6.0,随后的糖化过程中糖化使用的糖化酶最适作用pH为4.5,这两个步骤的pH调节会增加成本,并且目前使用的α-淀粉酶在淀粉深加工的高温液化过程易失活。因此开发在低pH值(4.5)下可高效液化淀粉的新型耐酸性高温α-淀粉酶具有重要的工业应用价值。本研究围绕地衣芽胞杆菌的耐热性α-淀粉酶基因进行分子改造,运用结构生物学、计算机模拟等技术进行理性设计,应用传统生物化学技术进行酶学性质测定和热稳定性分析,从分子水平揭示了突变提高耐酸性高温α-淀粉酶热稳定性的机制。本研究对文献报道的5种突变体、地衣芽孢杆菌耐酸性高温α-淀粉酶和商品的耐酸性高温α-淀粉酶进行了构建、表达和纯化,对这七种α-淀粉酶的酶学性质分析发现:在pH4.5条件下突变体BLA-m9和BLA-m6的热稳定性明显优于BLA和其它突变体;同时BLA-m9在pH4.5-5.0的范围内比活力最高,具有较好的耐酸性。在随后的序列对比分析中发现M15T和N188S位点突变可能对热稳定性有积极影响。在此基础上,以BLA-m9为模板构建了单点突变体 M15T、N188F、N188P、N188S 及其组合突变体 M15T/N188F、M15T/N188P、M15T/N188S。对这七个基于BLA-m9的突变体进行表达纯化、酶学性质分析和热稳定性分析,同时用光谱技术、动力学模拟技术对α-淀粉酶的结构进行分析,从分子水平研究Met15和Asn188残基的改变引起热稳定性改变的机制。研究发现BLA-m9-M15T、BLA-m9-N188S和BLA-m9-M15T/N188S分别保持100%、91%和91.5%的活力,明显高于BLA-m9的60%,并且在pH4.0-5.0范围内较BLA-m9的比活力有明显提升。其中BLA-m9-M15T在酸性条件下热稳定性提升的同时表达量也较BLA-m9有大幅提高,具有良好的工业应用前景。对荧光光谱谱图分析发现这三个突变体随着温度由25升高至95℃其荧光光谱没有明显的红移现象、表明其在高温下三级结构保持较高完整性,根据圆二色谱谱图计算二级结构含量发现在高温下二级结构保持较为完整;结构模拟结果表明BLA-m9-M15T、BLA-m9-N188S和BLA-m9-M15T/N188S突变体的15位点和188位点附近氢键网增强,动力学模拟结果体现出了突变体BLA-m9-M15T的15位点附近区域具有较高的灵活性,这些结果都预示着Met15和Asn188是维持BLA在酸性条件下热稳定性的关键残基,并从分子水平揭示了 M15T突变和N188S突变提高BLA-m9热稳定性的机制。这种基于结构预测的合理设计对于提高其他工业酶的热稳定性具有重要指导意义。这种应用光谱技术和模拟技术将蛋白结构和功能有效连接起来的研究方法对于蛋白质组学的研究具有重要意义。