细菌性食物中毒是影响我国食品安全的一个非常重要的因素。副溶血性弧菌是引起食物中毒的主要病原菌之一，每年夏秋季是副溶血性弧菌最适生长季节，也是其引起食物中毒的高峰期。人如误食染有此菌的水产品，很容易被感染，潜伏期一般2～26h，主要症状有腹痛、腹泻、呕吐和发烧等，水样粪便，少数呈血水样或粘液血便，严重的可能会危机生命。 本文通过制备副溶血性弧菌抗原，免疫新西兰大白兔获得效价高、特异性强的多克隆抗体，并利用此抗体进行间接ELISA试验，筛选出最适反应条件，建立了副溶血性弧菌间接ELISA检测法。此法具有检测时间短、特异性强、准确度高等优点，为食品中特别是水产品中副溶血性弧菌的检测提供快速准确的检测方法，并为食品中副溶血性弧菌的ELISA快速检测试剂盒的研制提供科学依据，也为副溶血性弧菌双抗体夹心ELISA检测法的建立提供理论依据，因此本实验具有很高的实际意义。 本课题主要从以下几方面进行了研究： 1、副溶血弧菌抗原和抗体的制备 本实验结合甲醛和热灭活法筛选出副溶血性弧菌最佳灭活条件：用0.05％(V/V)的甲醛、30℃条件下灭活副溶血弧菌4h制备抗原，并以此抗原分多次，剂量递增，免疫新西兰大白兔获得特异性多克隆抗体，以山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗，通过间接ELIASA法测定其多克隆抗体的效价、敏感性和特异性。结果表明：在免疫的第5周产生大量高效价抗体，效价最高可达1.6×10<5>：此多克隆抗体对副溶血弧菌检测灵敏度为1×10<4>cfu/mL；交叉反应和阻断试验结果显示此多克隆抗体具有很强的特异性，与鳗弧菌、溶藻弧菌、沙门氏菌等多种菌株均无交叉反应，因此可为间接ELISA检测法的建立、试剂盒的研制提供优质的多克隆抗体，为后续工作奠定基础。 2、间接ELISA检测法的建立 本文通过筛选试验，确定各检测步骤的最适合反应条件，并用棋盘滴定法抗原与抗体的最佳工作浓度，此法标准化后，其检测参数为：采用新的抗原包被法，60℃烘干包被，抗原包被浓度为10<7>cfu/mL：封闭时间为2.5h；一抗工作稀释度为1：4000；抗原、一抗孵育时间为75min；酶标二抗工作稀释度为1：1000；一抗与酶标二抗孵育时间为60min；酶与底物反应温度为30℃，时间为15min；孵育温度为37℃；运用此法对副溶血性弧菌菌悬液进行检测，检测阈为10<4> cfu/mL；检测时间为8h。 3、间接ELISA快速检测水产品中副溶血性弧菌 以此多克隆抗体作为一抗，山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗，建立副溶血弧菌的间接ELISA快速检测法。将该方法标准化后进行检测实验，交叉实验表明，此多克隆抗体与其它菌株交叉反应结果为阴性；阻断实验表明其具有较高的特异性，阻断率高达86.53％。运用此方法分别对人工染菌水产品及实际水产品进行检测，检测下限为10<4>cfu/ml，检测时间为8h；而将样品经过8h增菌培养后，检测下限可提高到10<3>cfu/ml。运用此法与常规方法分别对人工染菌水产品及实际水产品进行检测，其检测结果完全一致，因此本法可为检测水产品中副溶血性弧菌提供准确、快速的方法，具有很高的应用价值。 4 水产品中副溶血性弧菌间接ELISA快速检测试剂盒的初步研制 提出了水产品中副溶血性弧菌ELISA快速检测试剂盒的组成部件，使用说明，操作注意事项。并对本试剂盒各组分的保存期，试剂盒的稳定性、灵敏度、以及特异性进行了评价实验，结果表明本试剂盒可在4℃环境中，保存时间是3个月以上，具有良好的稳定性。可在8h内检测出10<4>cfu/ml浓度的副溶血性弧菌，经8h增菌培养后，其检测下限可提高到10<3>cfu/ml。并且起其他菌株无交叉反应。因此，本试剂盒具有一定的应用价值。