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2013年春,一种新型H7N9亚型流感病毒首次在我国华东地区的鸡群和人群中爆发开来,不仅给养禽业带来沉重打击,也对人类健康构成了严重威胁。目前,该病毒已在我国人群中连续引发了至少5波流行高峰,并且第5波次(2016～2017年)较之前的4个流行波次开始的时间更早,期间感染人数激增,感染区域也愈加广泛;此外,还出现了在HA基因的裂解位点处插入多个碱性氨基酸的高致病性(Highlypathogenic,HP)毒株。HA基因编码的血凝素是流感病毒表面主要的囊膜蛋白之一,不仅在病毒与宿主细胞唾液酸(Sialic acid,SA)受体结合、介导病毒囊膜和细胞膜融合过程中起到重要作用;还是流感病毒的主要抗原蛋白,能够刺激机体产生中和抗体;而且,在病毒致病性方面也发挥着重要作用。因此,研究H7N9亚型禽流感病毒HA基因随进化不断累积的关键氨基酸位点变异及其对病毒受体结合特异性、抗原性和致病性的影响,对于进一步揭示病毒的进化动态和指导疫苗设计以更有效地防控H7N9疫情具有重要意义。1.H7N9亚型禽流感病毒HA基因适应性变异的氨基酸位点分析通过检索全球禽流感共享数据库(the Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data,GISAID),对2013年以来收录的禽源H7N9亚型流流感病毒HA基因进行多序列比对,重点关注受体结构域(Receptor binding domain,RBD)附近的适应性氨基酸变异;并与人源H7N9毒株的相应位点进行对比分析。结果显示,共筛选出20个在禽源和人源H7N9病毒的HA上均具有随年代递进呈现明显规律性变异的氨基酸位点,其中位于RBD区的突变包括 A121T/P、S127N、A134V、R139K、L177I、M236I(以 H3 计数)这 6 个。在已报道的与H7N9流感病毒受体结合特性密切相关的HA关键位点中,绝大多数禽源和人源毒株均为138C、186V、193K、221P、226L和228G;但2017年度226Q在两种宿主源病毒中的占比均明显增加。2.高、低致病性H7N9亚型禽流感病毒拯救及其HA点突变重组病毒的构建为了研究上述筛选出的HA适应性位点变异及第158位附近糖基化位点的增减对H7N9病毒特性的影响,本研究基于反向遗传学技术分别构建了低致病性(Lowpathogenic,LP)病毒株TM24和HP病毒株GD15的8质粒系统,并成功拯救了 2株母本病毒rTM24(157-&160-)和rGD15(157-&160+);然后通过基因定点突变方式分别对其HA进行改造,构建并拯救了一系列点突变重组病毒,测定了它们的EID50、TCID50。结果显示,在LP rTM24(157-&160-)的 HA 骨架上分别进行 S127N、R139K、L177I、M236I 的单点突变和这4个位点的NRII、NKII联合突变时,除了重组病毒rTM-NRII在鸡胚和细胞上的复制能力较母本毒株有所减弱,其它点突变重组病毒的复制性能未发生明显改变;糖基化位点修饰的重组病毒中,rTM-1(157-&160+)在鸡胚上的复制被减弱,而rTM-2(157+&160-)和rTM-3(157+&160+)的体外复制能力均得到增强。对于HP rGD15(157-&160+)的HA骨架上引入点突变产生的重组病毒中,rGD-1(157-&160-)和rGD-2(157+&160+)的体外繁殖性能均有所降低,仅rGD-3(157+&160-)在鸡胚上的复制强于其母本。3.HA基因点突变重组H7N9病毒的受体结合特性、抗原性及对小鼠致病性首先利用固相直接结合ELISA试验测定了上述点突变重组H7N9病毒的受体特性。结果显示,以LP rTM24(157-&160-)为HA骨架时,不论是突变RBD区还是增加糖基化位点,9株点突变重组病毒的受体特性相较于母本均未发生明显改变,仍为可同时结合类禽α2,3-SA受体和类人α2,6-SA受体。而以HP rGD15(157-&160+)为HA骨架时,尽管3株点突变重组病毒仍和母本一致为双受体结合特异性,但它们对α2,6-SA受体的亲和力均有所提高。接下来,通过制备多抗血清进行交叉血凝抑制(Hemagglutinin inhibition,HI)试验对点突变重组H7N9病毒的抗原性进行了分析。结果显示,与LP和HP病毒株交叉反应性均较好的抗血清为 rGD-1(157-&160-)、rTM-1(157-&160+)和 rTM-S127N,HI 滴度分别为10±0.8 log2,9.2±0.8 log2 和 8.9±0.7 log2。而反应性相对较差的为 rTM-NKII、rTM-L177I和 rTM-NRII,HI 滴度分别为 6.1 土 1.3 log2、6.3±1.4log2 和 6.4±0.9log2。此外,抗原 R值的计算分析显示,以LP H7N9的HA为骨架的点突变重组病毒中,rTM-1(157-&160+)和rTM-NRII均与母本毒株间存在小的抗原性差异(R=0.5);以HP H7N9的HA为骨架的点突变重组病毒中,rGD-1(157-&160-)和rGD-3(157+&160-)也均相对母本毒株产生了抗原性差异,且rGD-3(157+&160-)与母本毒株间的抗原性有显著差异(R=0.35)。最后,测定了 HA第158位附近糖基化位点增减对重组H7N9病毒小鼠致病力的影响。结果显示,在LPH7N9点突变重组病毒中,rTM-1(157-&160+)能够引起小鼠体重更明显的下降,其在肺脏的复制能力也较强,对肺脏的侵袭性也更严重。而HP H7N9点突变重组病毒中,rGD-1(157-&160-)能使感染小鼠呈现严重肺炎症状,且攻毒后第3天肺脏内的病毒滴度显著高于母本,并极显著高于rGD-3(157+&160-)。综上所述,本研究基于LP和HP H7N9亚型禽流感病毒骨架,测定并分析了 HA基因RBD区关键氨基酸位点变异以及158位附近糖基化位点增减对受体结合特性、抗原性和小鼠致病性的影响。该结果可为深入探究H7N9病毒的进化规律、致病机制以及疫苗设计提供理论参考。