酶，是大自然所创造出来的一种奇妙的生物大分子。它在催化反应过程中所表现出来的独特性质，即较快的反应速度、高效的转化率、特异的底物专一性、高度的反应选择性以及接近中性的反应pH和温和的反应温度，吸引了众多科学家的目光。生物化学家始终希望能够发现酶发挥功能的秘密，创造出具有酶催化性质的物质。 在不断深入广泛的研究中，人们发现酶催化的基石是底物结合和分子内催化。酶在发挥催化功能的过程中，首先识别和结合底物，从而实现分子内催化，使酶底复合物转换成酶过渡态复合物。因此底物结合部位对于酶催化来说是十分重要的。利用化学和生物学的方法和原理，并结合以往的实验结果，我们在进行酶的模拟方面采取的策略是：首先产生一个具有底物结合位点的受体，然后将催化基团引入受体的底物结合部位附近，从而获得具有酶催化活性的分子。利用单克隆抗体制备技术是获得具有底物结合部位蛋白质分子的常规方法，因此，只要抗体分子底物结合部位附近的适当位置具有相应的催化基团，则该抗体分子就可能表现出酶的活性。 自上世纪九十年代开始，我们科研小组就用谷胱甘肽衍生物免疫小鼠，利用单克隆抗体技术得到了一系列的具有谷胱甘肽结合部位的单克隆抗体。最近，我们又将其中的一株2F3的重链可变区和轻链可变区克隆到大肠杆菌中，表达得到了一个新的单链抗体scFv2F3。因此根据我们的预想，这些抗体都可能具有或者通过改造后可能具有以谷胱甘肽作为底物的酶的活力。中文摘要 可溶性单链抗体的GST活性研究 由于包涵体形式表达的单链抗体是没有生物学活性的，需要在体外进行 重折叠。因此，我们选用了能够表达可溶性单链杭体的工程菌Ro se一2F3. 表达的目的蛋白质部分存在于细胞裂解液的上清中，利用目的蛋白C一末 端含有His6一Tag的性质，用NiZ冷属离子鳌合层析柱对其进行初步纯化，再用 高效液相对其进行进一步纯化。利用Westem Blot对所得蛋白质进行了鉴定， 证明所得到的蛋白质是目的蛋白scFvZF3，从而得到了可溶性的单链杭体 seFvZF3。 谷耽甘肤硫转移酶(GST)是以谷砒甘肤作为底物的酶类之一。它是细爵胞内解毒酶家族，催化谷耽甘肤与诸多内源性和外源性的亲电物质反应。尽 管所有的G ST都具有相似的三级结构和活性中心拓扑学，但是它们的催化基 团却显著不同，分为琳，ser和cys三种。在单链杭体scFvZF3分子中，存 在着许多Tyr、ser和Cys残基，特别是在CDRs区存在的Tyr、ser或cys残 基可能在空间上与谷耽甘肤的疏基接近，对催化反应的发生具有特殊的意义。 我们测定了可溶性单链杭体scFvZF3对多种亲电物质的催化活性，发现 它的GST(CDNB)活力为0.997 LJ/mg，GST(ETHA)活力为0.109 U/mg，GsT(对 硝基澳匆活力为3.646U加宕，GsT(C u0o均活力为0.928U加g。结果表明， 单链杭体scFvZF3具有GST活力，并由于它对e型GST的特征性底物表现出 催化活性.同时根据化学修饰scFvZF3中Ser后，scFvZF3丧失GST活性的 实验结果，推断出单链杭体scFvZF3具有GST催化能力的基团是Ser。 另外，我们还以CDNB为底物对单链杭体scFvZF3 GST活性进行了研究。 结果表明单链杭体scFvZF3 GsT活力的最适温度为44℃，最适pH值为pH 7.9。 动力学研究结果表明，单链杭体scFvZF3 GST活性催化反应机制遵循依次反应 机制或随机反应机制，它对两种底物的K五1都很低，但Kal值很小。这可能是由 于诱导单链杭体scFvZF3产生的谷耽甘肤衍生物结构与反应产物的结构非常 相似造成的，导致产物不能有效释放而延迟了反应的进行. 单链杭体scFvZF3表现出了GST活力不仅说明了杭体分子底物结合部位 的适当位置具有GST的催化基团Ser，还证实了我们最初的预想。这为我们 所进行酶模拟的策略提供了一个新的佐证。吉林大学博士论文张鳃含有硒代半脱氛酸的单链杭体在大肠杆菌中的表达 谷耽甘肤过氧化物酶(GPX)也是以谷耽甘肤作为底物的酶类之一它是生物机体内重要的杭氧化酶之一，在细胞、血液级组织中广发分布。它可以消除机体内的过氧化氢及脂质过氧化物，阻断氧自由基对集体的进一步损伤，从而保证细胞及组织正常生理功能的发挥。有些疾病如白内障、糖尿病、克山病及心血管疾病等发生时，机体内的GPX水平降低，导致自由基代谢紊乱。因此，GPX作为杭氧化药物有其重要的地位。但由于GPX在机体内的含量较低、稳定性差，不利于大规模制备及应用.因此科学家们将目光转向了GPX模拟物的研究。 硒代半耽氛酸(See)是GPX催化必需基团，被认为是第二十一种氨基酸。由于编码Sec的三联体密码子是通常作为终止子的UGA，而在所有已知能表达硒蛋白的组织中，uGA仍然保持其正常功能，因此，se。的掺入需要一特殊的调控机制。 硒代半耽氨酸的掺入机制十分复杂。在原核生物中，涉及到一个顺式作用元件和四个基因产物。顺式作用元件是位于mRNA密码子UGA3’端的一个特殊的茎一环结构，称为硒代半耽氛酸插入元件(selenoey