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柿单宁又称原花青素(proanthocyanidin,PA),是引起柿果实产生涩味的主要物质。其中完全甜柿(pollination constant&non-astringent,PCNA)在果实成熟时可在树上自然脱涩,采后即可脆食,其自然脱涩性状表现为质量性状遗传特点。而非完全甜柿需人工脱涩方可食用,其自然脱涩性状表现为数量性状遗传特点。多药和有毒化合物排出家族(MATE)为跨膜转运类蛋白,广泛参与次生代谢物向液泡中的转运,其可能与柿原花青素前体的选择性跨膜转运有关。Micro RNA(mi RNA)作为一类内源性非编码小分子RNA广泛参与调控植物的生长发育、次生代谢、生物和非生物胁迫等,但其在柿原花青素代谢中的功能还不明确。本研究首先从柿果实中克隆到一个参与柿原花青素前体跨膜转运的MATE蛋白基因(DkMATE1),并对其功能进行了验证。此外,对micro RNA数据库中与中国甜柿原花青素代谢相关的mi RNA进行筛选,鉴定了mi R858b及其靶基因DkMYB19和DkMYB20参与柿原花青素生物合成。主要结果如下:1.从中国甜柿‘鄂柿1号’中分离得到了一个DkMATE1基因。其在不同柿品种果实发育过程中的表达模式与原花青素含量的变化成正相关性。氨基酸序列分析和系统进化树分析表明DkMATE1编码一个原花青素前体跨膜转运蛋白,亚细胞定位显示其定位于液泡膜上。在‘磨盘柿’活体叶片中瞬时超表达和干涉表达DkMATE1能分别引起原花青素含量升高和降低,这些结果表明DkMATE1通过跨膜转运原花青素前体参与了柿原花青素的生物合成。2.从‘鄂柿1号’(花后15、20周)果实mi RNA数据库中筛选到与中国甜柿代谢相关的保守mi RNA 20个,柿特异mi RNA 29个。以‘鄂柿1号’转录组数据库为参照,通过靶基因在线预测软件ps RNATarget对上述mi RNA的靶基因进行预测分析,发现mi R858b预测靶定两个MYB转录因子,DkMYB19和DkMYB20。柿活体叶片瞬时超表达mi R858b可抑制DkMYB19和DkMYB20及原花青素合成途径相关结构基因的表达,降低原花青素的含量,而瞬时表达STTM858b(抑制mi R858b表达)可上调DkMYB19和DkMYB20及原花青素合成途径相关结构基因的表达,促进原花青素的积累,瞬时超表达DkMYB19或DkMYB20均能上调原花青素合成途径相关基因的表达,促进原花青素的积累。相似地,在柿果实圆片中瞬时转化mi R858b可减少原花青素的积累,瞬时转化STTM858b或DkMYB19或DkMYB20后促进原花青素的积累。拟南芥遗传转化mi R858b和柿组培苗叶片遗传转化DkMYB19或DkMYB20后,基因表达水平和原花青素含量变化与前述结果一致。因此,mi R858b通过抑制DkMYB19和DkMYB20的表达,调控柿原花青素的生物合成。3.以‘恭城水柿’为材料,DkANR为外源基因进行遗传转化,共获得转p H7GWIWG2(I)-GFP载体再生苗39株,阳性苗7株(17.9%)。转p H7GWIWG2(I)-DkANR载体再生苗135株,阳性苗20株(14.8%);对阳性苗中DkANR表达分析及原花青素含量测定分析,发现转p H7GWIWG2(I)-DkANR载体的阳性苗中DkANR的表达量显著降低,原花青素含量也显著降低。综上所述,本研究鉴定了一个柿原花青素前体跨膜转运蛋白基因DkMATE1,通过跨膜转运原花青素前体进入液泡,参与柿原花青素的生物合成。此外,从已有mi RNA数据库中挖掘了一个保守的mi R858b,其通过抑制DkMYB19和DkMYB20的表达,负调控柿原花青素的生物合成。该研究结果为进一步明晰柿原花青素代谢调控网络提供了新的科学依据。