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研究背景肝细胞癌(HCC)是全球癌症死亡的主要原因之一。包括HCC在内的肝癌的5年生存率只能达到18%,晚期HCC患者的临床治疗结果不佳的主要原因仍是肿瘤细胞对化疗药物的凋亡抵抗。因此,迫切需要进行更多的研究来探究HCC的有效治疗策略。内质网应激(ERS)是肝细胞癌中普遍发生的现象,是影响肝癌药物敏感性的重要原因,内质网应激除可改变肿瘤细胞的生物学表型外,还可明显降低肝癌细胞对化疗药物的敏感性。但内质网应激诱导肿瘤细胞耐药的机制尚不完全清楚,涉及多基因、多蛋白、多种信号通路,这为制定相关的治疗带来了很大的困难。内质网应激介导的自噬也是影响肝癌药物敏感性的重要原因,抑制自噬可以增加肝癌药物敏感性。但内质网应激调控自噬的机制尚不十分清楚。超级增强子(SEs)是目前肿瘤研究的热点,致癌的超级增强子存在于多种癌症亚型中,并且对于维持癌细胞的特性是必不可少的。与普通增强子相比较而言,超级增强子横跨了更大的基因组的区域,也会富集更多的转录因子、相关辅因子以及转录活性相关的组蛋白修饰。SEs驱动关键癌基因的表达,并赋予肿瘤依赖性,这最终为缺乏明确已知遗传驱动因素的癌症以及肿瘤的原发继发耐药现象提供了一个治疗思路。但超级增强子及其靶基因以及转录因子与ERS及自噬的关系、与肝癌药物敏感性的关系罕见报道。既然与普通增强子相比,超级增强子对于其结合的转录因子更有依赖性,这就启发我们可以以干扰超级增强子的相关转录因子为切入点,对肿瘤细胞凋亡抵抗过程中激活的基因进行转录水平的抑制。锌指蛋白263(ZNF263)是靶基因表达的主要调节因子,在HCC中被上调。然而,其在肝癌中的功能作用还有待研究。在当前研究中,我们发现ZNF263在内质网应激的细胞中被激活,在HCC患者和细胞系中被上调,且与肝癌细胞药敏性相关,但其与自噬的关系尚未见报道。它可能是HCC治疗的潜在靶标。目的发现肝癌细胞ERS潜在相关的超级增强子可能结合的转录因子。探究ERS潜在相关的超级增强子可能结合的转录因子对于肝癌细胞的增殖、凋亡抵抗等表型变化及药物敏感性的变化的影响。探究此转录因子影响肝癌细胞表型及药敏性的可能机制。方法(1)转录组测序鉴定内质网应激相关的m RNA。(2)组蛋白修饰H3K27ac Ch IP-seq鉴定诱导ERS后HCC细胞潜在相关的超级增强子,与转录组测序联合分析,进一步使用MEME软件预测ERS潜在相关SEs结合的转录因子。(3)组织芯片技术探究ZNF263在肝细胞癌病人癌与癌旁组织中的表达、生存曲线分析ZNF263与肝癌患者总体生存期的关系、与内网应激标志蛋白GRP78的关系、与自噬标志蛋白Beclin1、LC3的关系。(4)RNAi敲降ZNF263、CCK8、流式细胞术观察HCC细胞增殖能力和抗凋亡能力以及对索拉非尼敏感性的变化。(5)免疫荧光、Western blotting、电子显微镜、免疫组织化学技术观察RNAi干扰ZNF263的HCC细胞自噬水平的变化。(6)Western blotting、流式细胞术和免疫荧光技术,探究在衣霉素(TM)诱导及4-苯基丁酸(4-PBA)抑制内质网应激的HCC细胞中,ZNF263的表达变化、自噬水平和HCC细胞对索拉非尼的敏感性。(7)RNAi敲降ZNF263后,Western blotting、电子显微镜、流式细胞术观察ERS下HCC的自噬水平及HCC细胞对索拉非尼的敏感性。结果(1)转录组测序鉴定内质网应激相关的m RNA,302个基因明显上调,183个基因的表达水平明显下调(︱Log2FC︱≥1.5,p<0.05)。(2)组蛋白修饰H3K27ac Ch IP-seq发现ERS后肝癌细胞中有197个新出现潜在的超级增强子,与转录组上调基因交集得到17个ERS潜在相关的超级增强子及其调控的靶基因。MEME软件预测超级增强子相关的转录因子,发现ZNF263等4个转录因子可能与ERS潜在相关超级增强子存在结合。(3)组织芯片结果显示ZNF263在肝癌组织中表达上调,并与ERS标记蛋白GRP78的高表达和肝癌患者总体生存期缩短有关。(4)RNAi敲降ZNF263,增加了HCC细胞的增殖和抗凋亡能力,降低了HCC对抗癌药物的敏感性。(5)RNAi敲降ZNF263,Western blotting、电子显微镜结果显示肝癌细胞自噬水平降低。同时,免疫组化结果显示ZNF263的高表达与自噬标记蛋白Beclin1和LC3的高表达有关。(6)Western blotting、免疫荧光和流式细胞术数据表明,在衣霉素(TM)诱导的内质网应激HCC细胞中,激活的ZNF263降低了HCC细胞的药物敏感性。使用特异性抑制剂4-PBA抑制内质网应激,ZNF263被抑制,自噬被抑制,HCC细胞的药物敏感性增加。(7)RNAi敲降ZNF263,Western blotting及电子显微镜结果显示ERS下的HCC细胞自噬水平被下调,流式细胞术显示HCC细胞的药物敏感性增加。这表明ZNF263可能通过激活HCC细胞中与ER应激相关的自噬而增加HCC细胞的凋亡抗性。结论(1)ZNF263可能是ERS潜在相关超级增强子结合的转录因子之一,它在肝癌患者中表达上调,与肝癌病人预后不良相关。(2)ZNF263促进HCC细胞增殖及凋亡抵抗,降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性。(3)ERS是自噬的上游事件,ERS可以激活ZNF263的表达,进而激活HCC细胞中的自噬水平,参与ERS的HCC细胞对索拉非尼治疗的敏感性下降过程。因此ZNF263可能是ERS介导自噬从而引起肝癌细胞凋亡抵抗的关键机制之一。