【摘 要】
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鸭瘟病毒（Duckplaguevirus,DPV）是禽疱疹病毒之一,可引起鸭、鹅、大雁等雁形目禽类的急性、热性、败血性传染病,严重危害我国水禽养殖行业。LORF3基因为禽疱疹病毒特有基因,目前尚缺乏对其生物学特性进行描述的文献资料。本论文研究了DPVLORF3基因及其编码蛋白的基本生物学特性,并通过构建LORF3基因缺失病毒来评价LORF3基因对病毒对鸭致病性的影响,以期为新型疫苗的研发提供技术支
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鸭瘟病毒（Duckplaguevirus,DPV）是禽疱疹病毒之一,可引起鸭、鹅、大雁等雁形目禽类的急性、热性、败血性传染病,严重危害我国水禽养殖行业。LORF3基因为禽疱疹病毒特有基因,目前尚缺乏对其生物学特性进行描述的文献资料。本论文研究了DPVLORF3基因及其编码蛋白的基本生物学特性,并通过构建LORF3基因缺失病毒来评价LORF3基因对病毒对鸭致病性的影响,以期为新型疫苗的研发提供技术支撑。主要研究内容和结果如下:1.鸭瘟病毒LORF3蛋白基本生物学特性（1）制备兔抗LORF3蛋白多克隆抗体,经WB检测可特异性识别LORF3真核蛋白及DPV感染细胞后的LORF3基因编码蛋白。（2）q-PCR和WB分别检测LORF3基因转录及蛋白翻译情况,结果显示两者变化趋势与早期基因基本一致;GCV/CHX药物抑制试验进一步证实LORF3为早期基因。（3）利用蔗糖密度超速离心法获得纯化的DPV,基于兔抗LORF3蛋白多克隆抗体的WB检测结果表明LORF3蛋白存在于纯化的DPV粒子中,证实LORF3蛋白为病毒结构蛋白。（4）将LORF3真核质粒转染鸭胚成纤维细胞（DEF）,IFA检测到LORF3蛋白分布于整个细胞的胞核和胞浆;DPV感染DEF细胞后LORF3蛋白定位发生改变,主要分布于细胞核。2.LORF3蛋白对鸭瘟病毒生命周期的影响为解析DPVLORF3蛋白对病毒增殖的影响,本研究基于实验室搭建的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救平台（CHv-BAC）和Red同源重组技术无痕缺失LORF3基因,然后又将其回复,获得LORF3基因缺失病毒DPVCHv-ΔLORF3和回复病毒DPVCHv-ΔLORF3 Rev。（1）通过病毒滴度测定(TCID50)探究LORF3基因缺失病毒的体外生长动力学,结果表明LORF3蛋白对病毒复制是非必需的,但敲除LORF3基因后导致病毒增殖减弱。（2）q-PCR、TCID50等检测到LORF3蛋白不影响鸭瘟病毒的吸附、入侵、复制和释放;蚀斑实验显示DPV CHv-ΔLORF3感染DEF细胞时蚀斑面积显著减小,初步表明敲除LORF3基因会降低病毒在细胞间的传播效率。3.鸭瘟病毒LORF3基因缺失株对雏鸭的致病性研究（1）为探究LORF3蛋白对鸭瘟病毒毒力的影响,以TCID50为10~4、10~5、10~6的CHv-ΔLORF3缺失病毒、CHv-ΔLORF3 Rev回复病毒和nr CHv亲本病毒分别接种14日龄雏鸭。结果显示接种CHv-ΔLORF3 Rev和nr CHv的雏鸭出现体温升高和死亡,且雏鸭的体温和死亡率与接种病毒的滴度呈正相关,接种病毒滴度越高,雏鸭温度及死亡率越高;而CHv-ΔLORF3各组的雏鸭均未出现体温升高和死亡。（2）以不引起死亡的最高剂量(10~6TCID50)的CHv-ΔLORF3感染14日龄雏鸭,并设置CHv-ΔLORF3 Rev和nr CHv作对照,比较3株病毒感染鸭的组织病理变化、病毒载量等方面的差异。结果显示CHv-ΔLORF3 Rev和nr CHv感染组鸭的心脏、肝脏、脾脏、胸腺、十二指肠、食道膨大部与腺胃交界处、法氏囊等多个组织严重出血、坏死。而CHv-ΔLORF3感染组鸭仅脾脏出血、肿大,其余组织器官无可见病变,表明LORF3基因敲除后病毒毒力显著降低,LORF3基因为DPV毒力基因。（3）q-PCR检测CHv-ΔLORF3、CHv-ΔLORF3 Rev和nr CHv感染鸭体内的病毒载量,CHv-ΔLORF3组鸭各组织病毒载量始终低于CHv-ΔLORF3 Rev和nr CHv组,表明敲除LORF3基因会削弱DPV在雏鸭体内的增殖效率。综上,LORF3为DPV的非必需、早期基因,编码病毒结构蛋白,主要定位于DPV感染的细胞核。敲除LORF3后的DPV增殖效率降低、对鸭的毒力降低,有进一步研发为基因缺失标记疫苗的潜力。
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