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糖尿病外周血管病变(diabetic peripheral artery disease,PAD)是糖尿病(diabetic mellitus,DM)严重的慢性并发症之一,与非DM患者相比,其主要病理改变为动脉粥样硬化,且多累及下肢远端动脉,病变范围更广、呈多节段弥漫性的狭窄或闭塞,是导致DM足部坏疽、截肢的主要原因,严重影响DM患者的生存质量。目前传统内科药物、介入和手术治疗等对远端血管闭塞、流出道差的DM患者效果不佳,不能从根本上解决问题,并且此类DM患者多数高龄体弱,手术风险大,合并多种心脑血管病变,病情复杂,因此临床治疗上相当棘手,迫切需要寻求新的技术手段,如何促进血管新生实现血运重建成为治疗关键。近年来干细胞移植成为发展迅速的一种全新治疗模式,其中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)已被证实是一类具有多向分化潜能的干细胞,可以在一定的诱导条件下分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌、血管内皮细胞等,参与不同组织的修复,但目前仍缺乏移植细胞在体内存活、分化、转归及参与血管再生的实验依据可循,且骨髓MSCs采集风险较大,对患者年龄、身体条件、心理接受程度要求较高,在实际应用中,由于高糖、氧化应激、低氧等微环境使移植后MSCs的存活率非常低,新生血管形成速度慢等,极大地限制了干细胞移植治疗的效果。相比之下,脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)与BMSCs在生物学特性方面极为相似,由于其来源更广泛,采集方便,扩增力可塑性强,无免疫原性,不存在伦理学争议,具有更加有效的MSCs潜能,有可能成为BMSCs的理想替代物,成为目前诱导分化最佳的种子细胞。对血循环的重建而言,目前已知有多种细胞因子和生长因子参与促进血管生成作用,其中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)通过与其血管内皮特异性受体结合,可显著促进内皮增生及血管生成作用,被认为是机体内最强的促血管生长因子,但直接应用VEGF治疗存在很多不足,如半衰期短、提纯较为困难、应用量大、成本昂贵等,限制其临床应用。因此,如何提高MSCs在缺血组织存活、分化,增加局部组织生长因子分泌量,促进新生血管形成,提高MSCs治疗PAD疗效是目前亟待解决的主要问题。本研究利用基因工程构建VEGF-EGFP基因表达载体,通过腺病毒转染到h UC-MSCs细胞中,观察基因转染后对h UC-MSCs的生长增殖及目的基因VEGF表达情况;并利用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)实现转染后h UC-MSCs的活体示踪定位;同时建立高脂喂养2型糖尿病SD大鼠下肢缺血模型,将转染后的h UC-MSCs局部肌肉注射,观察其向血管内皮分化促血管新生,侧支循环的建立,改善下肢缺血的实验疗效;本研究应用h UC-MSCs作为VEGF基因治疗平台,不仅可通过提高VEGF持续分泌,达到局部稳定的治疗浓度,并通过VEGF的抗炎、抗氧化应激、抗凋亡、促进血管生成等作用改善缺血后微环境,为h UC-MSCs增殖、分化等过程提供最佳的生存空间;同时可放大h UC-MSCs的旁分泌作用,减少h UC-MSCs凋亡,提高h UC-MSCs移植后的定位归巢和存活率等,有效发挥VEGF与h UC-MSCs在血管再生功效方面的协同倍增作用,从而为更好的发挥h UC-MSCs移植疗效提供实验基础。本研究分为三部分:第一部分腺病毒介导VEGF转染脐带间充质干细胞的实验研究目的:探讨腺病毒载体介导VEGF转染h UC-MSCs的可行性,以及VEGF转染对h UC-MSCs形态及功能的影响。方法:构建VEGF-EGFP重组基因腺病毒载体,分离和培养h UC-MSCs,分为VEGF-EGFP转染组、EGFP空载组及对照组,荧光倒置显微镜观察细胞转染效果,流式细胞仪测定细胞转染效率,确定最佳病毒感染复数(multiplicities of infection,MOI);依据最佳MOI值转染并收集细胞,应用蛋白印迹法(Western blot)、RT-PCR检测转染后目的基因VEGF的蛋白及m RNA表达情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清VEGF蛋白水平,MTT法及流式细胞术评价基因转染对h UC-MSCs增殖和细胞周期的影响。结果:荧光显微镜及流式细胞仪检测提示腺病毒介导的VEGF-EGFP基因能够成功转染h UC-MSCs,且转染效率高,对细胞结构形态无影响;目的基因VEGF在细胞内能够转录和表达,并能分泌到细胞外,转染后24h采用ELISA法在细胞培养上清中就检测到有VEGF的表达和分泌,96h仍稳定表达;与对照组和EGFP空载组相比,通过Western blot、RT-PCR检测VEGF-EGFP转染组VEGF表达水平升高显著,且表达稳定,可提高h UC-MSCs的抗凋亡及存活能力;MTT及流式细胞法检测结果显示VEGF基因转染可提高h UC-MSCs增殖和分化能力。结论:腺病毒介导VEGF基因能够成功转染h UC-MSCs,能持续稳定、高效表达VEGF,改善生存微循环,提高h UC-MSCs的增殖及分化、存活能力,为开展VEGF基因转染h UC-MSCs移植治疗改善糖尿病下肢血管病变的可行性提供理论依据。第二部分高脂喂养2型糖尿病大鼠下肢缺血模型建立目的:目前普遍采用大鼠后肢股动脉结扎离断的方法来制备后肢急性缺血模型,但对于如何建立及评估糖尿病高脂高血糖慢性动脉硬化闭塞症的缺血状态,尚无一个稳定有效慢性缺血模型及方法。方法:将大鼠20只随机分为2组,DM组10只予以高脂喂养6个月,腹腔注射(Streptozocin,STZ)(35mg/kg)诱发糖尿病模型,对照组(10只)予以普食喂养6个月,成模DM组及对照组大鼠在麻醉后,消毒铺巾,沿右下肢正中的皮肤纵行切开,于腹股沟下分离出股动脉,在腹股沟韧带下切断股动脉,近端结扎,随后向远端锐性剥离直至膝关节,分离和结扎股动脉的所有分支,造成右下肢缺血模型,术后3d、7d、14d、28d观察大鼠患肢活动状况、肢体颜色、皮温等,并于术后1d、3d、14d、28d常规麻醉后,保持温度、光线相对恒定下,应用Peri Scan PIM3激光多普勒(Laser Doppler Perfusion Imaging,LDPI)行下肢血流监测。术后28d麻醉动物后,切开后腹膜,于腹主动脉留置套管针,肝素钠抗凝,以2 ml/s的速率注射造影剂约1.5 ml进行CT下肢血管造影。每组动物在血管造影后处死,分别取其健侧和患侧股四头肌和腓肠肌行苏木精-伊红染色及CD31免疫组织化学染色、Western blot测定肌肉组织VEGF含量。结果:DM组有(8只)对照组(10只)制备成后肢缺血模型,术后第1d,两组大鼠多普勒血流及CT血管造影均呈显著降低提示缺血造模成功,两组术后第7d和14d行激光多普勒提示缺血肢体血流有逐渐恢复趋势,术后第28d DM组血流恢复较对照组显著迟缓(P<0.05);CT血管造影:DM组右下肢股动脉结扎处近端仅有少量血管代偿性增加,远心端仍无明显血流;病理组织及免疫组化染色:术后第28d DM组缺血部位肌肉组织出现组织结构破坏,炎性细胞浸润,毛细血管密度患侧低于健侧;缺血肌肉组织VEGF较对照组的蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论:长期高脂喂养糖尿病模型基础上,制作股动脉结扎离断的下肢缺血模型,更接近于糖尿病下肢慢性缺血的情况,320排CT血管造影技术可以更立体直观评估缺血状态,为进一步探讨糖尿病下肢缺血病理机制及干细胞治疗促血管新生等提供了较为理想的动物模型及评估指标。第三部分VEGF-EGFP转染脐带间充质干细胞移植治疗改善糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究目的:通过腺病毒将重构的VEGF-EGFP基因转染到h UC-MSCs细胞中,同时建立高脂喂养2型糖尿病SD大鼠下肢缺血模型,将转染后h UC-MSCs局部下肢肌肉注射,观察血管新生,侧支循环建立,下肢缺血改善的实验疗效。方法:利用高脂饮食STZ诱导的2型糖尿病SD大鼠下肢股动脉结扎建立缺血模型后,将分组观察VEGF-EGFP-h UC-MSCs、EGFP-h UC-MSCs、h UC-MSCs及PBS局部肌肉注射到下肢缺血部位,荧光倒置显微镜观察移植细胞存活及定位;在治疗后2、4周,激光多普勒(瑞典Peimed,LDPI)检测局部血流;观察下肢活动度和缺血情况;4周后利用腹主动脉结扎行下肢动脉CTA(东芝320层CT机)造影检测双下肢血管侧支循环的形成;肌肉组织HE染色和CD31免疫组化检测新生毛细血管数量及密度;RTPCR、Western blot等检测组织标本中VEGF及MMP2,MMP9,TIMP1,TIMP2,ERK,AKt相关基因m RNA及蛋白的表达等。结果:移植后1、2、4周荧光显微镜下发现,在下肢缺血部位有移植的EGFP标记的h UC-MSCs存活;移植后2、4周LDPI血流图显示VEGF-EGFP转染组血流灌注的恢复水平要明显高于EGFP空载组,移植4周后CT血管造影显示VEGF-EGFP转染组有新生侧支循环,HE及免疫组化染色显示新生毛细血管明显高均于空载组,RT-PCR及Western blot检测组织标本VEGF-EGFP转染组VEGF、ERK、AKt、MMP2和MMP9 m RNA和蛋白水平较其他两组显著增高,TIMP1、TIMP2的表达无明显差异。结论:肌肉注射移植VEGF基因修饰后h UC-MSCs可在下肢缺血组织中定植存活,高效表达VEGF,促进内皮修复,比单纯h UC-MSCs更能有效地促进血管新生,明显改善糖尿病下肢缺血状态,为h UC-MSCs联合基因治疗糖尿病下肢血管病变提供新的理论依据。