蛋白质是一类非常重要的生物大分子,在物质代谢、细胞信息传递、个体生长发育等方面均有不可替代的作用。为了行使生物功能,蛋白质必须折叠成正确的天然结构,而错误折叠常常会引起蛋白质的聚集进而导致疾病的发生。真实生物体内的蛋白质是处于复杂的物理和化学环境中的,例如人类的大脑中就含有高浓度的渗透剂。关于渗透剂对蛋白质折叠动力学影响的研究已有不少,但大多都是以两态折叠的小蛋白质为研究对象。渗透剂对折叠机制较复杂、含有中间态并易聚集的蛋白质的折叠动力学的影响仍然了解不多。因此我们还研究了不同渗透剂对β-乳球蛋白解折叠中间态的影响。渗透剂不仅通过空间排斥效应等热力学机制起作用,同时还会引起粘度等动力学参数的改变,使得难以区分每种效应单独的影响。我们研究了渗透剂对几种两态折叠的蛋白质在动力学上的影响,发现渗透剂的影响与蛋白质本身的折叠动力学性质密切相关。蛋白质在体内时时刻刻受到机械力的牵引和拉伸,机械力同样能够使蛋白质解折叠,并具有与化学解折叠不同的特点。我们使用基于原子力显微镜的单分子力谱方法研究了配体-蛋白相互作用是怎样影响SH3的力学解折叠路径的,并发现同样的配体-蛋白相互作用对不同方向上的拉伸会有明显不同的影响。很多蛋白类药物都具有稳定性差、易聚集的缺点,人们发展了很多方法对蛋白质进行化学修饰,在一定程度上克服了这些问题,但是这些修饰方法影响蛋白质稳定性的内在物理机制,特别是对蛋白质折叠动力学的影响知之甚少,修饰位点以及修饰物的链长等因素对修饰效果的影响仍然缺乏定量描述。我们使用目前应用最广泛的聚乙二醇化修饰技术对SH3进行不同程度的修饰,测定了修饰后的SH3的热力学和动力学参数,并提出物理模型进行解释。本论文主要内容如下：第一章主要介绍了蛋白质的结构和蛋白质折叠的理论,并简单回顾了蛋白质折叠研究的发展历史。在这一章里还介绍了本论文使用的主要实验手段：停流(Stopped-Flow)技术和单分子力谱(Single molecule Force Spectroscopy, SMFS)技术。停流技术作为最常用的研究蛋白质折叠动力学的实验方法,使人们对蛋白折叠和解折叠路径有了直观的了解。而单分子力谱为人们研究机械力这一重要的因素对生物分子的影响提供了可能。单分子力谱技术具有传统方法所不具备的高分辨率,能够在单个分子的层次上观测到以往观测不到的罕见事件,使人们对生物分子结构和功能之间关系的理解更加深入。在第二章中,我们使用不同链长的PEG对SH3进行单位点和多位点修饰,并对分离后的修饰产物的热力学和动力学性质进行测定。我们发现N端单位点修饰对SH3的热力学和动力学性质均无明显影响,而多位点PEG化修饰能够明显增加SH3的热力学稳定性,并且这种热力学稳定性的增加主要来源于解折叠速率的减慢。我们还在前人理论的基础上推导了一个简单的物理模型来解释实验数据。第三章中,我们用快速混合停流技术研究了β-乳球蛋白在不同渗透剂条件下的热力学稳定性和解折叠动力学。β-乳球蛋白的解折叠含有明显的中间态,并且其中间态可以成为聚集的前体,因此研究渗透剂会如何影响这种中间态是有重要意义的。我们发现甘油能够增加β-乳球蛋白的热力学稳定性,并且显著减慢解折叠的快速相和慢速相,在动力学上稳定了中间态。PEG对β-乳球蛋白的热力学稳定性没有明显影响,也能够显著减慢解折叠过程中的慢速相,但对快速相仅轻微减慢。这种区别的原因是PEG能够通过疏水作用结合蛋白质暴露出来的疏水基团,因此其影响同时来源于空间排斥效应和疏水结合效应,而甘油不具备与蛋白质疏水基团结合的能力,其影响仅来源于空间排斥效应。第四章中,我们研究了渗透剂和粘度对四种相同大小的蛋白的折叠动力学的影响。目前己得到的实验结果显示,渗透剂对蛋白折叠动力学的影响与蛋白本身的折叠和解折叠速率明显相关。蛋白本身折叠越快,渗透剂加快其折叠的程度就越小；蛋白本身解折叠越快,渗透剂减慢的解折叠的程度就越大。在第五章,我们构建了多聚SH3蛋白。在SH3结合了配体的情况下,使用基于原子力显微镜的单分子力谱技术对多聚SH3进行不同方向的拉伸,来研究配体的结合对SH3的力学解折叠路径的影响。我们发现,从不同的拉伸方向和不同拉伸位点对蛋白进行拉伸,蛋白的力学解折叠性质是不同的。而配体的结合在不同的拉伸方向下也会表现出不同的效果。