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研究目的：
急性肺损伤（acute lung injury, ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）是重症监护病房常见的疾病，其发病率逐年增加。机械通气一方面提供呼吸支持，已成为急救和危重医学不可缺少的手段。另一方面，呼吸机的使用会导致肺组织损伤，这种由机械通气造成的肺损伤统称为“机械通气相关性肺损伤（ventilator-induced lung injury, VILI）”。然而，机械通气相关性的肺损伤其机制并不清楚，并且目前尚无有效的药物预防及治疗VILI，因此本课题希望通过机械通气和非机械通气小鼠的肺组织样本进行磷酸化蛋白组分析，确定 VILI 改变的磷酸化蛋白和主要信号通路，然后发现一种药物能够治疗VILI并明确其机制。雷公藤红素是一种从雷公藤中分离的三萜类化合物。研究发现雷公藤具有抗癌、抑制炎症反应、减少氧化应激、降低血压等作用，但目前尚未见雷公藤红素治疗VILI的研究报道。故本课题希望明确雷公藤红素是否对机械通气造成肺损伤具有保护作用，并在此基础上探讨其具体机制。
研究方法：
46只7-9周，体重23-28 g，ICR雄性小鼠。其中6只随机分为2组(每组3只)：空白对照组（control，Con），机械通气组（Ventilation , Ven）。机械通气组机械通气4小时，30ml/kg潮气量；应用磷酸化阵列pex100的进行磷酸化蛋白分析，然后对磷酸化蛋白进行基因本体论（gene ontology, GO）分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析以及蛋白质与蛋白质作用（protein protein interaction network, PPI）网络分析。剩余40只ICR雄性小鼠，随机分为 4组(每组 10 只)：空白对照组（Control，Con），空白对照+雷公藤红素组（Control+ Celastrol, Con+Ce），机械通气组（Ventilation, Ven），机械通气+雷公藤红素组（Ventilation + Celastrol , Ven+Ce）。在机械通气前三天，腹腔注射雷公藤红素（1 mg/kg）每天一次，直到机械通气当天；机械通气30ml/kg共4h 后取小鼠的肺组织，进行测定肺组织湿/干重比（W/D）测定，冰冻切片来进行H&E 染色观察肺组织病理改变，应用试剂盒检测肺组织髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)含量的变化，并用酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA）检测肺组织中白细胞介素-1β(IL1-β)、白细胞介素-6( IL-6)、白细胞介素-10( IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量进行检测。Westernblot用于测定p-P38, p-JNK1/2蛋白含量的变化。RT-PCR测定Collagen-1， TGF-β 表达量的变化。
研究结果：
以差异倍数（fold-change ＞±1.5倍）与P值（P＜0.05）作为筛选差异蛋白的标准，共筛选出约115个差异表达的磷酸化蛋白质，其中37个磷酸化蛋白表达增加， 78个磷酸化蛋白表达减少。通过GO功能分析解析了参与VILI的生物过程（主要为细胞周期调节、对化学刺激物的细胞反应等）；通过KEGG富集功能分析了参与VILI的主要信号通路[P13K-Akt信号通路、黏着斑信号通路、神经营养因子信号通路以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路等]。通过 PPI分析工具分析了参与 VILI损伤权重较大的蛋白质为周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase-1, CDK1)，RELA，Ras相关的C3肉毒素底物-1(Ras-relat-ed C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)等。同时雷公藤红素对VILI的肺保护作用得到了证实，首先形态学上 H&E 染色可发现雷公藤红素能够明显减少肺组织肺泡壁水肿程度，减少中性粒细胞的聚集，减轻炎性反应；干湿比重数据说明雷公藤红素可明显减少肺组织水肿：肺干湿比 Ven 组明显高于对照组，Ven+Ce 组明显高于Con+Ce组，但明显低于Ven组，（P均＜0.01），Con组跟Con+Ce组无明显差异（P＞0.05）。雷公藤红素还可明显减少肺组织氧化损伤：机械通气4h可诱导肺组织中氧化物质MPO及MDA明显增加（P均＜0.01），抗氧化物质SOD明显减少（P＜0.01），而雷公藤红素能明显降低 MPO（P＜0.01）及 MDA（P＜0.01），增加SOD（P＜0.05）的释放。同时雷公藤红素可减轻炎性损伤及肺纤维化：机械通气组肺组织中促炎因子 IL-1β、IL-6 、TNF-α 蛋白表达发生了显著性提高（P 均＜0.01），抗炎因子IL-10明显降低（P＜0.01），雷公藤红素可减轻机械通气相关性的IL-1β和IL-6及TNF-α表达，增加IL-10表达（P均＜0.01）；在肺纤维化损伤方面，本实验检测了肺纤维化标记Collagen-1在机械通气时明显增加（P＜0.01），给予雷公藤红素后明显降低改善（P＜0.01）；同时促肺纤维化 TGF-β 蛋白在 Ven+Ce组少于Ven组，结果具有统计学意义（P＜0.05）。本实验检测了可能参与其机制的MAPK 信号通路蛋白 p-P38 及 p-JNK1/2，发现机械通气能明显增加 p-P38 及p-JNK1/2蛋白的表达，给予雷公藤红素能明显减少其表达。
研究结论：
众多磷酸化蛋白参与了机械通气相关性肺损伤，其中115个基因表达的磷酸化蛋白质表达显著差异；通过GO功能富集及KEGG通路富集分析提示，参与机械通气相关性肺损伤主要通路有 MAPK 信号通路等。给予药物雷公藤红素可以明显对抗机械通气诱发的肺损伤，一方面抑制炎症反应和减少氧自由基含量，另一方面减少肺纤维化，并抑制MAPK信号通路中p-P38蛋白、p-JNK1/2表达，说明雷公藤红素通过 MAPK 信号通路实现机械通气相关性肺损伤的保护作用。最终通过本实验期望能为治疗VILI提供新的思路与方法。
急性肺损伤（acute lung injury, ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）是重症监护病房常见的疾病，其发病率逐年增加。机械通气一方面提供呼吸支持，已成为急救和危重医学不可缺少的手段。另一方面，呼吸机的使用会导致肺组织损伤，这种由机械通气造成的肺损伤统称为“机械通气相关性肺损伤（ventilator-induced lung injury, VILI）”。然而，机械通气相关性的肺损伤其机制并不清楚，并且目前尚无有效的药物预防及治疗VILI，因此本课题希望通过机械通气和非机械通气小鼠的肺组织样本进行磷酸化蛋白组分析，确定 VILI 改变的磷酸化蛋白和主要信号通路，然后发现一种药物能够治疗VILI并明确其机制。雷公藤红素是一种从雷公藤中分离的三萜类化合物。研究发现雷公藤具有抗癌、抑制炎症反应、减少氧化应激、降低血压等作用，但目前尚未见雷公藤红素治疗VILI的研究报道。故本课题希望明确雷公藤红素是否对机械通气造成肺损伤具有保护作用，并在此基础上探讨其具体机制。
研究方法：
46只7-9周，体重23-28 g，ICR雄性小鼠。其中6只随机分为2组(每组3只)：空白对照组（control，Con），机械通气组（Ventilation , Ven）。机械通气组机械通气4小时，30ml/kg潮气量；应用磷酸化阵列pex100的进行磷酸化蛋白分析，然后对磷酸化蛋白进行基因本体论（gene ontology, GO）分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析以及蛋白质与蛋白质作用（protein protein interaction network, PPI）网络分析。剩余40只ICR雄性小鼠，随机分为 4组(每组 10 只)：空白对照组（Control，Con），空白对照+雷公藤红素组（Control+ Celastrol, Con+Ce），机械通气组（Ventilation, Ven），机械通气+雷公藤红素组（Ventilation + Celastrol , Ven+Ce）。在机械通气前三天，腹腔注射雷公藤红素（1 mg/kg）每天一次，直到机械通气当天；机械通气30ml/kg共4h 后取小鼠的肺组织，进行测定肺组织湿/干重比（W/D）测定，冰冻切片来进行H&E 染色观察肺组织病理改变，应用试剂盒检测肺组织髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)含量的变化，并用酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA）检测肺组织中白细胞介素-1β(IL1-β)、白细胞介素-6( IL-6)、白细胞介素-10( IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量进行检测。Westernblot用于测定p-P38, p-JNK1/2蛋白含量的变化。RT-PCR测定Collagen-1， TGF-β 表达量的变化。
研究结果：
以差异倍数（fold-change ＞±1.5倍）与P值（P＜0.05）作为筛选差异蛋白的标准，共筛选出约115个差异表达的磷酸化蛋白质，其中37个磷酸化蛋白表达增加， 78个磷酸化蛋白表达减少。通过GO功能分析解析了参与VILI的生物过程（主要为细胞周期调节、对化学刺激物的细胞反应等）；通过KEGG富集功能分析了参与VILI的主要信号通路[P13K-Akt信号通路、黏着斑信号通路、神经营养因子信号通路以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路等]。通过 PPI分析工具分析了参与 VILI损伤权重较大的蛋白质为周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase-1, CDK1)，RELA，Ras相关的C3肉毒素底物-1(Ras-relat-ed C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)等。同时雷公藤红素对VILI的肺保护作用得到了证实，首先形态学上 H&E 染色可发现雷公藤红素能够明显减少肺组织肺泡壁水肿程度，减少中性粒细胞的聚集，减轻炎性反应；干湿比重数据说明雷公藤红素可明显减少肺组织水肿：肺干湿比 Ven 组明显高于对照组，Ven+Ce 组明显高于Con+Ce组，但明显低于Ven组，（P均＜0.01），Con组跟Con+Ce组无明显差异（P＞0.05）。雷公藤红素还可明显减少肺组织氧化损伤：机械通气4h可诱导肺组织中氧化物质MPO及MDA明显增加（P均＜0.01），抗氧化物质SOD明显减少（P＜0.01），而雷公藤红素能明显降低 MPO（P＜0.01）及 MDA（P＜0.01），增加SOD（P＜0.05）的释放。同时雷公藤红素可减轻炎性损伤及肺纤维化：机械通气组肺组织中促炎因子 IL-1β、IL-6 、TNF-α 蛋白表达发生了显著性提高（P 均＜0.01），抗炎因子IL-10明显降低（P＜0.01），雷公藤红素可减轻机械通气相关性的IL-1β和IL-6及TNF-α表达，增加IL-10表达（P均＜0.01）；在肺纤维化损伤方面，本实验检测了肺纤维化标记Collagen-1在机械通气时明显增加（P＜0.01），给予雷公藤红素后明显降低改善（P＜0.01）；同时促肺纤维化 TGF-β 蛋白在 Ven+Ce组少于Ven组，结果具有统计学意义（P＜0.05）。本实验检测了可能参与其机制的MAPK 信号通路蛋白 p-P38 及 p-JNK1/2，发现机械通气能明显增加 p-P38 及p-JNK1/2蛋白的表达，给予雷公藤红素能明显减少其表达。
研究结论：
众多磷酸化蛋白参与了机械通气相关性肺损伤，其中115个基因表达的磷酸化蛋白质表达显著差异；通过GO功能富集及KEGG通路富集分析提示，参与机械通气相关性肺损伤主要通路有 MAPK 信号通路等。给予药物雷公藤红素可以明显对抗机械通气诱发的肺损伤，一方面抑制炎症反应和减少氧自由基含量，另一方面减少肺纤维化，并抑制MAPK信号通路中p-P38蛋白、p-JNK1/2表达，说明雷公藤红素通过 MAPK 信号通路实现机械通气相关性肺损伤的保护作用。最终通过本实验期望能为治疗VILI提供新的思路与方法。