马铃薯SRF家族特征分析及StSRF1基因对青枯菌侵染响应的功能研究

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青枯病(Bacterial wilt)是马铃薯(Solanum tuberosum)生产中严重的病害。SRF是一种亮氨酸重复类受体激酶(LRR-RLK),在生长发育、感受生物与非生物胁迫及免疫应答等过程中发挥着关键作用。SRF的研究主要集中于拟南芥,然而对马铃薯SRF基因家族了解非常有限。本研究首先利用生物信息学方法从进化树、基因结构、保守结构域、共线性、染色体定位、启动子分析以及热图等多方面对马铃薯的SRF进行了全基因组分析。其次使用青枯菌(Ralstonia solanacearum)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)和油菜素内酯(BR)处理马铃薯幼苗,诱导St SRF1基因表达。然后通过半薄组织切片技术观察细胞壁厚度变化。通过亚细胞定位明确St SRF1蛋白的定位情况。最后对马铃薯SRF家族成员St SRF1基因进行了抗性功能研究,通过在本氏烟草中进行病毒诱导的基因沉默(PYY13-Nb SRF1)和异源瞬时过表达(p TRV2-St SRF1)以及转基因拟南芥中组成型过表达St SRF1基因(OE1和OE4)进一步研究其对青枯菌的应答反应。主要研究结果如下:1.生物信息学分析鉴定了在马铃薯基因组中存在56个St SRF基因,其中St SRF1基因长度为2121bp,编码706个氨基酸,含有LRRNT结构域,跨膜结构域和PKniase结构域。SRF基因家族中71%的SRF基因含2-5个外显子,暗示着有一定程度的变异。热图分析显示St SRF基因与生长发育有关。St SRF基因的启动子含有多个胁迫和激素反应元件,暗示可能在胁迫反应和相应的激素信号通路中发挥作用。2.定量PCR结果显示植物激素(ABA,SA,Me JA和BR)和青枯菌处理马铃薯可以诱导St SRF1基因上调表达。BR能显著上调St SRF1的转录水平且高于SA和ABA处理诱导的水平。St SRF1基因能在较短时间内迅速且强烈响应青枯菌的诱导表达。因此,St SRF1基因可能通过BR、SA和ABA激素信号通路在马铃薯青枯病抗性机制中发挥潜在作用。3.半薄组织切片结果显示St SRF1基因可能促进了胼胝质的沉积并导致细胞壁增厚,阻止青枯菌在植株中的进一步增殖。4.激光共聚焦显微镜观察表明St SRF1-GFP蛋白定位于细胞质膜上。5.利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法对St SRF1的同源基因Nb SRF1进行功能损失分析。结果表明,沉默株系青枯菌含量增多且病症严重,沉默植株较对照植株相比活性氧和胼胝质沉积减少。因此,Nb SRF1基因沉默的烟草株系对青枯病的抗性降低。6.利用病毒诱导的过表达(VOX)方法对St SRF1进行功能增益分析,实现了St SRF1在烟草中的异源过表达。结果显示,过表达株系中青枯菌增殖减少且缓解了青枯病症状。过表达植株中胼胝质,活性氧及细胞死亡增加,同时植株体内脯氨酸,过氧化物酶,超氧化物歧化酶活性增加。因此St SRF1参与了PAMP触发的PTI信号途径,提高了青枯病的抗性。7.通过拟南芥稳定遗传过表达进一步验证了St SRF1在抗青枯病中的作用。St SRF1基因的过表达表现出对青枯病更高的抗性。以上结果显示:定位于细胞质膜上的St SRF1基因参与PAMP触发的PTI免疫反应,通过BR防御信号主导途径协同SA和ABA激素信号途径共同调节植物对青枯菌的系统获得抗性(SAR)反应。这些结果有助于对St SRF1基因的潜在的抗病机制的阐释。
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