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研究背景及目的据国际癌症中心估计,2014中国癌症中肝癌死亡率男性19.6%,女13%。男性新发病例高达293318人之多,可见我国原发性肝癌研究的重要性及紧迫性。原发性肝癌作为我国高发危害极大的恶性肿瘤之一,典型的微环境特征是血管的增长速度低于瘤体的增殖速度,从而使血液供应不足导致瘤体内的低氧,当氧浓度低至1%时,机体出现明显的应激反应,并导致低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)显著增高,HIF-1α是介导细胞对肿瘤缺氧微环境适应性反应的关键转录调控因子,可激活多条相关通路及下游调控蛋白,在维持肿瘤细胞存活、增殖、血管生成等方面发挥重要作用,因此研究HIF-1α的调控通路对肝癌研究至关重要。本课题组关注的Hsp90的新底物蛋白,Bcl-2相关转录因子1(Bcl-2-associated transcription factor 1,BCLAF1)从发现至今,被报道涉及多种细胞生物进程,在RNA的调控和促肿瘤细胞增殖中有着不容轻视的作用。有研究提示,BCLAF1与肿瘤血管生成和转录调控有关,那么它是否会与HIF-1α存在一定的关系?因此本课题从体内和体外多角度,探讨肝癌细胞中BCLAF1与HIF-1α之间的关系,及其具体的调控机制;通过下调BCLAF1观察其对肝癌细胞的生长及增殖的影响;为进一步探索BCLAF1参与肝癌发生发展的分子机制,以及为肝癌治疗的药物设计和防治,提供新的思路。研究方法:1.CCK-8检测细胞增殖;结晶紫检测细胞克隆数;台盼蓝染色检测细胞活性2.Annexin V-FITC和PI染色检测细胞凋亡3.RT-PCR法检测细胞内基因表达4.Western Blotting法、免疫荧光检测细胞内蛋白表达5.免疫共沉淀(Co-IP)检测蛋白的相互作用关系6.免疫组化染色检测瘤体内蛋白的表达7.质粒的转化与细胞转染8.染色质免疫共沉淀(ChIP)检测蛋白与染色质的结合9.双荧光素酶检测报告基因10.实验数据均以x±s进行表示,采用SPSS 22.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(One WayANOVA),进一步进行实验组与对照组的比较用Dunnett法。两独立样本组间比较采用t检验。检验水平为P<0.05。研究结果1.BCLAF1与HIF-1α两蛋白表达水平呈正相关关系肝癌病人肝组织样本中BCLAF1与HIF-1α均高表达,两蛋白的表达呈正相关。且在HepG2和Huh7细胞中BCLAF1与HIF-1α的表达具有低氧作用时间依赖性。2.低氧下BCLAF1通过HSF1调控HIF-1α的表达低氧下敲低BCLAF1可下调HSF1的表达及活性,而HIF-1α启动子上游有HSF1的结合位点,因此干扰BCLAF1后HSF1与HIF-1α启动子的结合减少从而下调HIF-1α的表达。3.低氧下HIF-1α调控BCLAF1的表达低氧下敲低HIF-1α可下调BCLAF1的蛋白表达量,但BCLAF1的mRNA水平升高。究其原因:发现HSF1于BCLAF1启动子上游有结合位点,低氧下干扰HIF-1α后HSF1与BCLAF1启动子结合增多导致BCLAF1转录增多;但有维持BCLAF1蛋白稳定作用的HSF1的蛋白和mRNA均表达下降,其活性标志蛋白HSP70的转录活性降低、蛋白水平下调导致BCLAF1无法维持一个稳定的蛋白构象。进而将HepG2和Huh7细胞瞬时干扰HIF-1 α的同时分别用CHX、MG132作用后,BCLAF1蛋白表达量在MG132作用后有所恢复;而在CHX作用后其表达量更低。提示BCLAF1通过泛素蛋白酶体途径降解。4.BCLAF1对原发性肝癌有增殖抑制作用低氧下敲低BCLAF1可抑制肝癌细胞的增殖。同时在体内下调BCLAF1后可下调肝癌瘤体中HIF-1α的表达量。研究结论1.本研究发现在肿瘤低氧下BCLAF1高表达,且首次发现与HIF-1α的表达呈明显正相关。2.BCLAF1与HSF1是两个相互结合作用的蛋白,BCLAF1可调控HSF1的表达及活性。3.低氧下BCLAF1通过HSF1调控HIF-1α的表达;同时在体内下调BCLAF1后可下调肝癌瘤体中HIF-1α的表达量。4.低氧下HIF-1α通过HSF1影响BCLAF1的表达。5.低氧下敲低BCLAF1可抑制肝癌细胞的增殖。