论文部分内容阅读
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是HER家族的主要成员之一，是一类跨膜糖蛋白，由胞外域、跨膜区和胞内域三个区域组成，胞外域含配体结合区，胞内域含有酪氨酸激酶活性区。目前已发现约30%的上皮癌为EGFR过表达，其中包括非小细胞肺癌、头颈癌、结直肠癌、脑胶质瘤、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌和胃癌等，且该类表型的肿瘤患者预后差、转移快、对放疗与化疗抗拒和生存期较短。因此，EGFR是上皮癌治疗的理想靶分子，也是国际上第一个恶性肿瘤治疗分子靶。针对EGFR胞外域的单克隆抗体和作用于胞内域酪氨酸激酶抑制剂属于抗EGFR肿瘤新药研发的最热门的两大领域，然而统计数据表明，在临床上仅有10-30%的EGFR阳性患者对该类药物有反应。尽管原因复杂多样，肿瘤患者EGFR胞外域及胞内域发生缺失或突变是目前治疗策略失效的主要原因之一。对于EGFR家族来讲，在绝大多数情况下“二聚化”是受体活化（磷酸化）必须经历的途径，而参与二聚体形成的“界面区域”暴露则是二聚体形成的必要条件。因此，我们认为，采取“二聚化靶向”策略，能够有效提高EGFR肿瘤治疗措施的临床反应率和疗效。单克隆抗体是针对特定单一抗原决定簇产生的抗体，能特异性结合、杀伤靶细胞。本实验拟以实验室前期工作中分离鉴定的一个EGFR的B细胞表位肽—EGFR267-297为抗原，通过免疫原性分析确定最佳免疫原构建形式，制备一类鼠源性靶向EGFR二聚体界面区的单克隆抗体，评价体外抑瘤活性及分析其生物学特性，为以后单克隆抗体人源化改造及体内实验打下良好基础。方法：1比较四种不同EGFR267-297构建形式免疫肽的免疫原性戊二醛偶联法得到偶联肽BSA*EGFR267-297和OVA*EGFR267-297，将实验室之前构建的两种融合肽MVF-EGFR267-297，P64K-EGFR267-297和偶联肽P64K*EGFR267-297与本实验构建的偶联肽BSA*EGFR267-297作为免疫原免疫Balb/c小鼠，以OVA*EGFR267-297作为检测抗原用间接ELISA法检测血清效价，选用最高效价的构建形式作为制备单克隆抗体的免疫原。2制备EGFR二聚化界面单克隆抗体用免疫原性最高的免疫原免疫Balb/c小鼠，ELISA法检测血清效价。用常规方法建立单克隆抗体杂交瘤细胞株，腹腔注射Balb/c小鼠得到腹水型单抗，用PEG6000沉淀法及Protein A柱纯化单抗， ELISA法检测腹水型单抗效价，并进行亲和力常数测定和单抗亚类、轻链鉴定。3单抗体外抑瘤效果分析MTT法检测EGFR267-297mAb对EGFR过表达人乳腺癌细胞MDA-MB-231以及EGFR正常表达的小鼠成纤维细胞3T3细胞增殖抑制。4单抗生物学特性分析用流式细胞术分析单抗诱导MDA-MB-231细胞凋亡率；用激光共聚集法观察单抗诱导MDA-MB-231细胞凋亡时细胞形态学的改变；激光共聚集法观察EGFR267-297mAb与EGFR过表达MDA-MB-231细胞及LLC细胞表面结合与内化。结果：1比较四种不同EGFR267-297构建形式免疫肽的免疫原性四种免疫原中以BSA*EGFR267-297免疫原性最高，所以选用它作为制备单克隆抗体的免疫原，以OVA*EGFR267-297作为检测抗原，排除背景。2制备EGFR267-297单克隆抗体常规杂交瘤手段制备6株高效价稳定分泌的单克隆抗体杂交瘤细胞株，单抗纯化后纯度可达95%，重链约50kDa，轻链约25kDa与文献报道一致，单抗效价最高者超过1：2560000，单抗选用其中四株高效价的单抗测定亲和力均属高亲和力单抗（K﹥1089），单抗亚类、轻链鉴定结果显示3株为IgG1，1株为IgG2a，轻链都为Kappa。3单抗体外抑瘤效果分析EGFR267-297mAb(200μg/ml)、西妥昔单抗阳性对照组对MM-231细胞的增殖抑制率分别是29.37%及31.60%，3T3细胞的增殖抑制率分别是4.85%及3.93%，说明对EGFR267-297mAb对EGFR过表达的恶性肿瘤细胞有明显抑制作用且对正常细胞的副作用较小，抑制率与上市药物西妥昔单抗接近。4单抗生物学特性分析流式细胞术分析结果表明EGFR267-297mAb高中低三个浓度梯度诱导MDA-MB-231细胞早期凋亡率分别为：41.3%、43.7%、57.4%，晚期凋亡率分别为：20.8%、28.6%、13.4%，总凋亡率分别为：62.1%、72.3%、70.8%，比西妥昔阳性组的凋亡率更高。用激光共聚集法观察单抗诱导MDA-MB-231细胞凋亡时细胞染色质明显皱缩，周边化，周围有颗粒状的散在点；激光共聚集法观察EGFR262-292mAb能特异性地结合到MM-231细胞及LLC细胞表面并内化。结论：成功制备6株靶向EGFR二聚体界面能够稳定分泌的高效价单克隆抗体杂交瘤细胞株，制备的单抗对EGFR过表达细胞增殖有显著的抑制作用，并能显著诱导细胞凋亡，而且在体外能特异性地与EGFR过表达细胞结合，为下一步体内实验打下良好基础。