论文部分内容阅读
桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)是热带和亚热带最重要果蔬害虫之一,该虫危害超过250种植物,其中包括柑桔、香蕉、芒果、番石榴和甜瓜等主要经济水果。由于桔小实蝇寄主范围广、繁殖高、适应能力和扩散能力较强。目前为止,已经严重限制当地的水果产业的发展并且被许多国家列为重要的检验检疫害虫。由于桔小实蝇的生物特性,使用化学农药难以防治而且会造成田间生态环境的破坏、农药残留及食品安全问题。另外,当前甲基丁香酚的雄虫诱杀防控技术也暴露了防控效果的不足问题。据此亟须突破以往的模式,发展一个高效、安全、环境友好型的防控策略。桔小实蝇与大多数昆虫一样,利用嗅觉系统识别食物气味或信息素进而取食、求偶交配和产卵。然而,关于桔小实蝇嗅觉感受机制以及感知特定气味分子的基因功能所知有限。气味结合蛋白Odorant-binding proteins(OBPs)、化学感受蛋白Chemosensory proteins(CSPs)、气味受体Odorant receptors(ORs)、离子型受体Ionotropic receptors(IRs)和感觉神经元膜蛋白Sensory neuron membrane proteins(SNMPs)是昆虫识别各种气味化合物的主要嗅觉感受蛋白,特别是OBP、OR和IR被认为是新型昆虫嗅觉行为调控剂的重要分子靶标。前期研究工作已经对桔小实蝇的四个虫态(卵、幼虫、蛹和成虫)转录组进行分析,鉴定了昆虫化学感受感受基因并调查了化学感受基因的组织表达情况,据此推导了桔小实蝇触角中可能参与气味分子识别的嗅觉感受基因。为了探索桔小实蝇对引诱化合物识别蛋白分子,开展以下相关研究:(1)比较分析了雌雄虫在未性成熟、性成熟或产卵期对寄主化合物和引诱化合物嗅觉行为反应和触角电位反应,同时也比较分析触角特异、性信息素感知相关气味结合蛋白和其他嗅觉感受基因在雌雄虫在不同生理时期的表达水平差异;(2)通过结合荧光结合能力试验和分子对接研究了触角高表达的气味结合蛋白与引诱活性化合物结合能力;(3)采用RNA干扰RNA interference(RNAi)研究了气味结合蛋白Bdor OBP83a-2的嗅觉功能,通过抑制该基因转录水平,并比较干涉前后对特异的气味化合物的触角电位和嗅觉行为表型差异。具体的研究内容与研究结果如下:1)为了明确桔小实蝇在未性成熟、性成熟/产卵期对引诱化合物趋性选择变化是否与嗅觉周缘感受系统相关。通过昆虫嗅觉行为测试比较分析了桔小实蝇雌雄虫在未性成熟、性成熟或产卵期的对引诱化合物的偏好性差异。结果表明,雌雄虫在性未成熟对已知引诱化合物几乎都没有明显趋性反应。相反,雌雄虫在性成熟时期对绝大部分的引诱化合物都具有明显趋性反应。与行为反应测定结果相似,雌虫在产卵期对大多数引诱化合物的触角电位反应显著高于刚羽化时期,而雄虫对某些化合物的触角电位反应也有一定程度增强,特别是性成熟雄虫对松柏醇的触角电位反应明显强于未性成熟雄虫。比较性成熟雌虫对多种气味的触角电位反应,雌虫对γ-辛内酯、γ-壬内酯、1-辛烯-3-醇、惕各酸乙酯、苯甲酸乙酯的电位反应明显高于其他供试化合物。为了探究桔小实蝇周缘神经系统中的嗅觉感受基因的表达差异是否引发嗅觉偏好、嗅觉敏感性的差异,采用实时荧光定量q RT-PCR检测了前期研究获得的桔小实蝇9个触角高表达OBP以及性信息素结合蛋白相关基因(PBPRP)(Bdor OBPlush,Bdor OBP19a,Bdor OBP19d-1,Bdor OBP28a,Bdor OBP56h,Bdor OBP69a,Bdor OBP83a-1,Bdor OBP83a-2,Bdor OBP84a-1)、1个触角高表达的CSP(Bdor CSP3)、1个ORCO(Bdor ORCO)和2个触角高表达特异表达SNMP1直系同源基因(Bdor SNMP1-1和Bdor SNMP1-2)在未性成熟、性成熟或产卵期的差异表达情况。结果显示:(1)产卵期雌虫触角中5个OBP(Bdor OBP19a、Bdor OBP19d-1、Bdor OBP69a、Bdor OBP83a-1和Bdor OBP83a-2)的表达量发生显著上调。而性成熟雄虫触角中Bdor OBP83a-2的表达量发生显著上调,而其他OBP的表达均无显著变化。(2)产卵期雌虫Bdor SNMP1-1的表达量发生显著下调,而Bdor ORCO和Bdor SNMP1-2的表达均无显著变化。(3)雄虫触角中8个OBP(Bdor OBP19d-1、Bdor OBP56h、Bdor OBP69a、Bdor OBP83a-1、Bdor OBP83a-2、Bdor OBP84a-1、Bdor OBP84a-2、Bdor OBPlush)的表达量在交配时期的下午显著上调。在雌虫中,只有Bdor OBP69a发生上调,其他均无发生变化。(4)雄虫触角的Bdor ORCO、Bdor SNMP1-1和Bdor SNMP1-2的表达量在交配时期的下午显著上调,而雌虫触角均无发生变化。2)为了探明桔小实蝇OBP和CSP参与其嗅觉识别过程中的功能及其与不同气味化合物的结合特性,通过对桔小实蝇5个触角特异/高丰度表达的OBPs(Bdor OBP56h、Bdor OBP83a-1、Bdor OBP83a-2、Bdor OBP84a-1和Bdor OBP84a-2)和1个触角高表达的Bdor CSP进行原核表达,分离纯化后,采用荧光竞争结合测试研究了这些重组蛋白对13种气味化合物的结合能力。结果表明,除了Bdor CSP3和Bdor OBP84a-2外,其他OBP均能与测定化合物结合,两个同源OBP(Bdor OBP83a-1和Bdor OBP83a-2)与供试气味化合物的结合能力强于其他OBP,Bdor OBP83a-2的结合能力为最高。根据结合常数显示Bdor OBP83a-1与甲基丁香酚、酯类化合物均有强的结合能力,其强弱顺序依次为:甲基丁香酚、γ-壬内酯、DELTA-辛内酯、γ-十一内酯、γ-辛内酯。通过对上列OBP和CSP进行三维模型构建、优化以及分子对接,分析了与供试气味化合物亲和性。综合结合能力测试和分子对接数据,分析认为Bdor OBP83a-2是识别具有引诱活性气味化合物的重要气味结合蛋白。3)为了确定Bdor OBP83a-2的嗅觉识别功能,选择了甲基丁香酚和γ-辛内酯作为测定引诱化合物,通过ds RNA的微注射抑制桔小实蝇雌雄虫触角的Bdor OBP83a-2表达,并采用触电电位记录其干涉前后的触角电位反应和干涉前后的嗅觉行为表型。结果表明RNAi抑制Bdor OBP83a-2的转录水平下降,导致雌雄虫对甲基丁香酚和γ-辛内酯的触角电位反应明显下降,而且干涉Bdor OBP83a-2后对甲基丁香酚和γ-辛内酯的敏感性显著降低,直接证明了Bdor OBP83a-2是调控桔小实蝇趋性行为的气味结合蛋白。