研究目的：组织工程血管的发展有望成为解决临床上移植血管不足的难题,目前在国外的研究中应用生物反应器构建组织工程血管部分产品已进入临床研究。在国内的组织工程血管的相关研究中,由于起步相对比较晚,目前尚无较大的突破。本研究以左心辅助系统罗叶泵为驱动装置,完善罗叶泵泵体内的压力分布数据,测定不同频率以及压力大小的情况下出血及入血口的压力跨瓣压差的变化。采用压力导丝技术,定点监测细胞培养部分中硅胶不同位点的压力情况,计算出系统的压力衰减情况。最后以脐动脉血管平滑肌细胞为种子细胞,聚羟基乙酸为支架材料在以罗叶泵为驱动装置的血管生物反应器中进行初步的实验,观察整个系统的运行情况,为下一步的工作构建一定的基础。方法：一、血管生物反应器的构建：查阅相关文献,将血管生物反应器系统设计为两个部分,分别是细胞培养部分及外循环控制部分,并对系统的各部分相配配件进行设计及制作。二、罗叶泵内的相关力学测试：罗叶泵跨瓣压差的测定：将罗叶泵与玻璃容器相连,开动左心辅助循环气体驱动装置,观察各接头间有无漏液。如无漏液,则进一步排除管道内残存的气体。应用穿刺针在罗叶泵上穿刺,沿着穿刺针送入压力导丝,并将压力导丝依次送至流入道及流出道的位置,另选一根穿刺针在流入道入血口及流出道出血口的硅胶管上穿刺送入压力导丝。调节不同的压力参数及频率,并根据压力导丝测得的数据,记录罗叶泵内流入道、流出道压力以及流入道外、流出道外的压力大小,根据上述测得的压力计算出流入道及流出道的跨瓣压差的大小。流入道跨瓣压差=罗叶泵内流入道的压力-流入道外压力,流出道跨瓣压差=流出道内压力-流出道外压力,以流入道跨瓣压差及流出道跨瓣压差为因变量,压力及预设频率为自变量进行Pearson相关分析。生物反应器系统的压力衰减率测试：将罗叶泵和蠕动泵依次与生物反应器的细胞培养部分相连,穿刺针在内硅胶管入水端穿刺后送入压力导丝,依次测定,内硅胶管入口端、内硅胶管近端1/4、内硅胶管中点、内硅胶管远端1/4、内硅胶管出口5点的最大压力值。调节不同的模式：依次测定罗叶泵100/-10mmHg60/分、100/-10mmHg70/分、100/-10mmHg80/分、110/-10mmHg60/分、110/-10mmHg70/分、110/-10mmHg80/分、120/-10mmHg60/分、120/-10mmHg70/分、120/-10mmHg80/分及转子泵100转/分、200转/分、300转/分,记录各测压点的最大压力值。绘制不同模式下生物反应器系统的压力衰减曲线。三、罗叶泵为驱动装置的生物反应器的初步应用：1.应用组织贴块法原代培养脐带血管平滑肌细胞,对获得的细胞株进行传代扩增,应用α-actin免疫组化的方法鉴定原代培养获得的细胞是否为血管平滑肌细胞。2.以聚羟基乙酸无纺布为支架材料,将经过免疫组化鉴定的血管平滑肌细胞种植在上面,将细胞与支架复合物在培养箱中培养24小时,倒置显微镜及扫描电镜观察细胞与支架结合的情况。3.生物反应器中血管平滑肌细胞接种与加压培养：取生长良好的脐动脉血管平滑肌细胞,消化后离心,加入新鲜培养基配成5×106/ml浓度的细胞悬液,均匀的种植在PGA支架上,盖上装备有无菌过滤器的通气小孔的硅胶盖,使生物反应器成为相对密闭的无菌培养环境。用硅胶管连接左心辅助泵及贮液瓶,开动左心辅助泵,设定参数为(100mmHg,60bpm),其中一条血管为动态培养,另一条血管为对照组无加压培养,连续培养4周。培养4周后取材,观察其大体形态,中性甲醛固定,常规石蜡包埋行HE染色,显微镜下观察血管的形态并拍照。结果：一、血管生物反应器的构建：细胞培养部分构造为玻璃生物生物反应器、硅胶盖、硅胶管及相应的变径接头构成,其中将聚羟基乙酸无纺布缝合于内硅胶管上,经消毒后再在支架上种植种子细胞,形成支架-种子细胞复合物,外循环系统提供的压力可通过内硅胶管作用于支架-细胞复合物,从而模拟细胞在体内所受到的张力环境。外循环控制部分主要由气体驱动装置,罗叶泵(L-Y泵),储液瓶及硅胶管以及变径接头构成。其中储液瓶内装的为含有左氧氟沙星的双蒸水,由于罗叶泵独特的设计可以模拟人体心脏射血,驱动管道系统内的液体流动产生对内硅胶管的脉动式张力。二、罗叶泵内的相关力学测试。罗叶泵跨瓣压差的测定：频率固定时,随着罗叶泵输出的压力增大,流入道及流出道的跨瓣压力均呈增大的趋势,且流入道的跨瓣压差要明显大于流出道的跨瓣压差。当罗叶泵的输出压力固定时,随着输出频率的增加,流入道跨瓣压差呈增大的趋势,而流出道的跨瓣压差则出现略微下降的情况。实验证明,罗叶泵的流入道以及流出道的跨瓣压差与罗叶泵的频率及输出压力密切相关,且频率及压力对流入道的跨瓣压差的影响要大于对流出道跨瓣压差的影响。以流入道跨瓣压差及流出道跨瓣压差为因变量,预设压力及频率为自变量进行Pearson相关分析。结果提示：流入道跨瓣压差与预设压力(r=0.650,P<0.001)及频率(r=0.427,P<0.05)均呈正相关,流出道跨瓣压差与频率呈负相关(r=-0.253,P<0.05),与预设压力呈正相关(r=0.707,P<0.001)。生物反应器系统的压力衰减率测试：系统的压力入口端与出口段不相等,提供的压力有一定的衰减,压力衰减的比例波动于0.6-0.73之间。系统由转子泵及罗氏泵提供的压力于硅胶管发生形变不是完全对等的关系。罗叶泵做为驱动装置,系统提供的压力相对稳定,压力衰减率波动于0.66-0.73之间。频率升高,压力变化不明显。系统由转子泵提供的压力与转速明显相关,随着转速升高,压力升高,衰减率降低。三、罗叶泵为驱动装置的生物反应器的初步应用1.脐动脉组织原代培养第6-7天,可见少量长梭形细胞从组织块周围爬出,细胞数量逐渐增多,彼此融合,并密集分布,培养20天可见细胞长满培养瓶,细胞分布呈典型的“峰一谷”样特征。α肌动蛋白免疫组织化学染色鉴定,可见细胞胞浆内可见沿长轴分布的棕红色肌丝,肌丝所在的胞浆及细胞核不着色,证实所培养的细胞为脐动脉平滑肌细胞。2.细胞与支架复合物的观察：进过氢氧化钠预处理PGA支架后,在PGA支架上种植血管平滑肌细胞,培养24小时,电镜扫描。电镜下可见细胞与支架结合较紧密,细胞伸出伪足在支架上吸附,倒置显微镜下可见细胞在PGA支架上生长,细胞形态与二维平面培养不同,在支架上呈球形。3.生物反应器中血管平滑肌细胞接种与加压培养：系统运行4周,无发生污染。无压力培养获得的平滑肌细胞组织与加压培养的组织相比,可见局部出现PGA的脱落,血管管壁不完整,HE染色镜下见加压培养血管外层胶原致密,结构层次感好。无加压培养获得的血管,细胞外基质胶原紊乱,缺乏层次感。结论：1.本研究成功构建出以罗叶泵为驱动装置的血管生物反应器系统。2.在罗叶泵的泵体中由于瓣膜结构的存在以及管腔直径的改变,对流过的液体会存在一定的阻滞作用而产生跨瓣压差。跨瓣压差在压力相同的情况下,流入道的跨版压差总体上随着频率的增加而增加,而流出道的跨瓣压差随着频率的增加而呈下降趋势,在相同频率的条件下,随着压力的升高,流入道及流出道的跨瓣压差均呈上升的趋势。3.罗叶泵作为驱动装置提供压力,提供的压力在生物反应器中有一定的衰减,与转子泵相比罗氏泵提供的压力较为稳定,频率升高,压力变化不明显。且系统提供压力的衰减率相对稳定,转子泵提供的压力,转速升高,压力升高,衰减率降低。4.以罗叶泵为驱动装置构建的血管生物反应器初步试验,运行4周,系统运行稳定,无发生污染,动态加压与静态培养相比,所形成的血管平滑肌组织,细胞外所产生的胶原纤维更多,血管管壁更厚,组织血管切片见细胞外胶原排列更有序,提示一定方向的应力可以引起血管平滑细胞发生重分布,且对细胞外基质的分泌有促进作用。