前言心脏纤维化（Cardiac Fibrosis,CF）是心脏组织中的瘢痕形成过程,其特征是I、III型胶原沉积增加,心脏成纤维细胞激活并分化为具有分泌胶原能力的肌成纤维细胞,最终增加心室僵硬度并启动舒张功能异常。而冠状动脉微血管病变（Coronary Microvascular Disease,CMD）可诱发心脏纤维化、导致射血分数保留的舒张功能不全,越来越引起临床的关注。因此预防和逆转心脏纤维化具有重要意义。冠脉微血管病变本质是指影响冠状动脉微循环结构和功能的疾病,特别是心脏微血管内皮细胞在维持心脏功能和心脏重构过程中发挥重要作用。同时,内皮细胞是成人心脏组织中数量最多的细胞类型,且与相邻的心肌细胞、成纤维细胞直接接触。另外,在临床病例中,冠脉微血管病变越来越多独立于冠状动脉大血管疾病涌现出来,目前尚无针对性治疗方案。因此,明确心脏纤维化的作用机制和干预靶点,可为冠状动脉微血管病变带来针对性的防治措施。钙蛋白酶-1（Calpain-1）及钙蛋白酶-2（Calpain-2）均为异质二聚体,分别包含Capn1及Capn2编码的特定亚基（80kDa）及调节钙蛋白酶活性Capn4（28kDa）控制的共同亚基。因此敲除Capn4会抑制钙蛋白酶的同工型;同时,细胞内钙离子浓度和特异性内源性钙蛋白酶抑制素（Calpastatin）调节。越来越多的证据表明,上皮间质转分化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）参与组织纤维化病变,表现为成纤维细胞在纤维化起始大量增生。肌成纤维细胞已被确定为负责纤维化进展的细胞,包括多个来源:组织内静止的成纤维细胞、循环系统中CD34阳性的成纤维细胞及各种细胞类型转化并激活的肌成纤维细胞;其中,内皮细胞可以通过内皮间质转分化（Endothelial-Mesenchymal Transition,EndMT）过程,最终变为成纤维细胞和（或）肌成纤维细胞。探索内皮间质转分化机制对心脏纤维化病理进程具有重大研究意义。内皮细胞通过间质转分化过程,变为成纤维细胞及（或）肌成纤维细胞、分泌细胞外基质蛋白,其病理性累积可造成心脏纤维化,从而致心脏微循环受阻、最终破坏正常心脏结构、造成心脏重构。到目前为止,非心肌细胞在心脏组织中发生的心脏重构及纤维化的作用尚不清楚;同时,考虑到心脏组织中内皮细胞数量最多,因此我们拟针对内皮细胞探讨内皮细胞特异性钙蛋白酶是否通过内皮-间质转分化参与心脏组织中内皮细胞表型转换以及心脏成纤维细胞发生细胞增殖,最终促进心脏纤维化。目的探索内皮细胞特异性钙蛋白酶抑制,可以通过热休克蛋白90（Heat Shock Protein 90,HSP90）/Akt信号通路抑制内皮细胞间质转分化及心脏成纤维细胞增殖,从而最终达到改善心脏纤维化的作用。方法利用转化生长因子（Transforming Growth Factor,TGF-β1,10ng/ml）和钙蛋白酶抑制剂III（20μM）或Akt抑制剂（LY294002,20μM）诱导体外培养的小鼠心脏微血管内皮细胞（Mouse Cardiovascular Endothelial cells,MCECs）。应用TGF-β-1及HSP90抑制剂（17AAG,20μM）诱导新生胎鼠分离的心脏成纤维细胞,分析在内皮-间质转分化过程中是否发生细胞增殖。建立针对小鼠内皮细胞的Capn4基因敲除（Capn4-Knockout,Capn4-KO）鼠模型。并在Capn4-KO小鼠及其野生型同窝仔畜中诱发了模仿心脏肥大和纤维化的病理模型。组织学分析用于测量心肌细胞横截面积和心脏组织中所含的胶原蛋白含量。进行免疫荧光分析,以证明内皮细胞通过间质转分化过程,转变为成纤维细胞和（或）肌成纤维细胞,分泌胶原并沉积于细胞间隙、最终导致心脏纤维化。结果内皮细胞特异性缺失Capn4消除了钙蛋白酶-1及2的活性,降低了心脏组织中胶原蛋白含量、缩小心肌细胞横截面积。离体分析Evans Blue染色法显示相比于盐水对照组而言,异丙肾上腺素处理组中心肌细胞膜通透性增高,表明加剧细胞死亡;而Capn4基因敲除组则可以减轻该过程。同时,体外培养的心脏微血管内皮细胞中,钙蛋白酶抑制可逆转由TGF-β1诱导的内皮-间质转分化过程;钙蛋白酶内源性抑制素过表达则同样逆转内皮-间质转分化过程。表现为内皮细胞发生转变:在TGF-β1诱导下,具有更多的间质标记物,例如α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,而内皮细胞标记物减少,例如血管内皮粘着蛋白（Vascular endothelial cadherin,VE-cadherin）;钙蛋白酶抑制后则反之。TGF-β1诱导激活钙蛋白酶后上调磷酸化的Akt、从而促进内皮-间质转分化进程;而钙蛋白酶抑制通过HSP90/Akt信号传导途径在内皮-间质转分化过程及成纤维细胞增殖中启动保护机制。结论这些研究证明了钙蛋白酶内皮细胞中通过HSP90/Akt信号通路参与其向间质细胞表型转分化及成纤维细胞增殖的作用,并最终改善心脏纤维化。体内实验验证了内皮细胞特异性Capn4基因敲除通过逆转内皮-间质转分化过程、从而减轻心肌细胞肥大、细胞死亡及胶原沉积。结果表明,抑制内皮细胞特异性钙蛋白酶是延缓心脏纤维化的新型治疗靶点。