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目的:目前,心血管相关疾病（cardiovascular disease,CVD）仍是人类健康的首要威胁。血管重构（vascular remodeling）是CVD基础病理生理学改变。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）增殖、迁移以及合成分泌在血管重构中发挥关键作用,进而导致包括高血压、动脉粥样硬化和血管内再狭窄等多种疾病[1,2]。作为血管壁的主要细胞构成,VSMCs生理条件下表现为高度分化状态,即“收缩型”表型（也被称为“静止型”）,维持正常的血管收缩舒张功能。收缩型VSMCs具有相当低的增殖和迁移能力。不同于高度分化的骨骼肌或心肌,VSMCs高度保留了细胞的可塑性,病理条件下其表型可能发生转换。VSMCs由收缩表型向合成分泌表型转化时,VSMCs表现出异常的增殖、迁移、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）分泌活性,从而导致血管重构诱发疾病。因此,明确VSMCs增殖、迁移和分泌机制对抑制血管重构、防治CVD具有重要临床意义。肾素-血管紧张素系统（renin angiotension system,RAS）是血管功能最主要的调节系统。目前认为,RAS系统的主要生物学效应由血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ）产生。大量文献表明Ang-Ⅱ作为一种有力的VSMCs表型转化促进因子,可以有效的促进VSMCs由“静止”状态向增殖、迁移和分泌能力活跃状态转化,从而导致血管重构[3,4]。自噬是溶酶体介导的细胞内物质动态循环过程。细胞通过自噬消化自身受损胞质物质作为“原料”以更新胞内细胞器或生成自身代谢所需物质。自噬被越来越多的实验证实为VSMCs发生表型转化的其中一个重要机制。Ang-Ⅱ是自噬的诱导因素已被大量实验证实。其作用机制是激活AT1受体、NADPH氧化酶和线粒体KATP通道。Septins家族传统上作为GTP结合蛋白一直以来在细胞动力学和微丝形成能力方面被广泛讨论。随着科学研究的深入,多项其他领域的生物学效应也被揭示,这些效应包括膜动力学、细胞骨架重组、囊泡运输和肿瘤发生[5]。Septin4是Septins家族内一个亚型,具有GTP酶活性。人类Septin4基因编码两种主要蛋白异构体:Sept4＿i1（H5/PNUTL2）和Sept4＿i2/ARTS。Septin4被认为是细胞骨架的重要组成被广泛表达于真核细胞内,并与多重要的生理活动相关[6],因而其功能发生改变可导致多种病理现象发生,包括小肠干细胞生存、小鼠精子活力、肝脏纤维化、亨廷顿病（Huntington’s disease,HD）等。我们的团队新近研究结果显示,Septin4作为一个重要调控因素参与了氧化应激导致的血管内皮细胞损伤,而其作用机制则是通过与凋亡相关蛋白PARP1相互作用[7]。而作为与VSMCs无论是从功能上还是结构上都密切联系的VSMCs,目前尚未有文献报道Septin4是否对VSMCs的病理生理具有调控作用。我们旨在对Septin4在Ang-Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移过程中是否发挥效应进行验证,并探讨其机制是否与自噬相关。研究方法:1、复制小鼠血管重构模型。选取8周龄的雄性C57B6小鼠12只。随机选取6只作为Ang-Ⅱ干预组,其余6只为对照组。诱导麻醉后在干预组小鼠背部皮下植入微量注射泵,泵内预充Ang-Ⅱ,以1.5mg/kg/天持续输注小鼠体内。对照组小鼠植入的微量注射泵内预充生理盐水。14天后处死全部小鼠。提取小鼠主动脉组织。对小鼠主动脉组织行HE染色检测主动脉血管壁（内膜-中膜）厚度,以及Masson染色检测主动脉血管壁内胶原纤维含量评估纤维化程度。2、提取小鼠主动脉组织蛋白,通过Western blot检测Ang-Ⅱ干预组和对照组血管组织内Septin4蛋白表达含量,对比两组差异。3、培养人主动脉平滑肌细胞（Human aortic smooth muscle cells,HASMCs）,分别用梯度浓度为0M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M的Ang-Ⅱ处理细胞48h。通过CCK-8实验检测细胞增殖活力,通过transwell实验检测细胞迁移能力。提取5组细胞内总蛋白,用Western blot检测Septin4蛋白表达水平,对比组间差异。4、通过质粒转染在HASMCs内建立Septin4过表达模型,细胞分为两组:Flag-Septin4（过表达Septin4）和Flag-control（对照）组。分别用梯度浓度为0M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M的Ang-Ⅱ处理细胞48h。通过CCK-8实验检测细胞增殖活力。将细胞分为Flag-Septin4、Flag-Septin4+Ang-Ⅱ、Flag-control、Flag-control+Ang-Ⅱ四组,通过transwell实验检测细胞迁移能力,对比4组细胞迁移数目的差异。5、对Flag-Septin4、Flag-Septin4+Ang-Ⅱ、Flag-control、Flag-control+Ang-Ⅱ 4组HASMCs提取蛋白,通过Western blot检测相关蛋白表达:增殖能力标志物PCNA,合成能力标志物col-1,迁移能力标志物MMP2,自噬流标志物p62和LC3（Ⅱ和I）,对比4组蛋白含量差异。6、将HASMCs分为6组:Flag-Septin4、Flag-Septin4+Ang-Ⅱ、Flag-Septin4+CQ（氯喹）、Flag-Septin4+Ang-Ⅱ+CQ、Flag-control、Flag-control+Ang-Ⅱ)。通过CCK-8实验检测细胞增殖活力。以及transwell实验检测细胞迁移能力。收集细胞提取总蛋白,通过Western blot检测相关蛋白表达:PCNA,col-I,MMP2,p62和LC3（Ⅱ和I）,对比6组蛋白含量差异。7、将Flag-Septin4组HASMCs提取总蛋白,免疫沉淀目标蛋白Septin4及其相互作用蛋白后通过凝胶电泳分离,染色后切取含差异蛋白复合物的胶片行蛋白质谱分析。结果:1、14天后,HE染色显示Ang-Ⅱ干预组小鼠主动脉血管壁内膜-中膜厚度显著高于对照组。Masson染色显示Ang-Ⅱ干预组小鼠主动脉血管壁胶原蛋白含量显著高于对照组,血管纤维化水平增高。2、Western blot法显示Ang-Ⅱ干预组小鼠主动脉血管壁内Septin4蛋白含量显著高于对照组,约为对照组3倍。3、加入Ang-Ⅱ后,HASMCs迁移数目增多,并且细胞迁移数目随着Ang-Ⅱ干预浓度的增强而增加。加入10-5M Ang-Ⅱ的细胞迁移数目显著增多,较未加药组增加超过1倍。加入Ang-Ⅱ后,HASMCs活力升高,并且细胞活力随着Ang-Ⅱ干预浓度的增强而增加,加入10-5M Ang-Ⅱ的细胞活力显著增多,较未加药组增加超过1/3。免疫组化结果显示,加入Ang-Ⅱ后HASMCs内Septin4蛋白含量增加,并且二者之间存在量-效关系,Ang-Ⅱ浓度越高,细胞内Septin4蛋白表达水平越高。加入10-5M Ang-Ⅱ的细胞Septin4蛋白表达水平显著增多,是未加药组的3倍以上。4、CCK-8结果显示,与Flag-control组类似,Flag-Septin4组HASMCs加入Ang-Ⅱ后细胞活力增加,并且细胞活力随着Ang-Ⅱ干预浓度的增强而增加,加入10-5 M Ang-Ⅱ的细胞活力显著增多。Flag-Septin4和Flag-control组细胞相比,没有加入Ang-Ⅱ时,Flag-Septin4组细胞活力轻度低于Flag-control,但这种差异不具有统计学意义。而在分别加入10-8 M、10-7 M、10-6 M、10-5 M的Ang-Ⅱ后,Flag-Septin4组细胞活力均显著低于相同Ang-Ⅱ浓度干预下的Flag-control组。综合以上实验结果,我们从中选取10-6 M作为最适Ang-Ⅱ浓度用于以后干预组实验。Transwell结果显示,与Flag-control组类似,Flag-Septin4组HASMCs加入Ang-Ⅱ后细胞迁移数目显著增加。Flag-control组HASMCs加入Ang-Ⅱ后细胞迁移数量约是未加药组的3倍,而Flag-Septin4组细胞加入Ang-Ⅱ后细胞迁移数量约是未加药组的2倍,在分别加入10-6 M的Ang-Ⅱ后,Flag-Septin4组细胞迁移数量显著低于Flag-control组。5、Westerm blot结果显示,Flag-control组HASMCs加入Ang-Ⅱ后细胞增殖标志物PCNA蛋白表达显著增加,Flag-Septin4组加入Ang-Ⅱ后PCNA表达也显著增加。在分别加入Ang-Ⅱ后Flag-Septin4组PCNA蛋白表达显著低于Flag-control组。Flag-control组HASMCs加入Ang-Ⅱ后细胞合成分泌的col-1蛋白表达显著增加。Flag-Septin4组加入Ang-Ⅱ后col-1表达也显著增加。在分别加入Ang-Ⅱ后Flag-Septin4组col-1蛋白表达显著低于Flag-control组,约为Flag-control的3/5。Flag-control组HASMCs加入Ang-Ⅱ后细胞迁移标志物MMP2蛋白表达显著增加,超过未加药组1.5倍以上。Flag-Septin4组加入Ang-Ⅱ后MMP2表达也显著增加,但超过未加药组不到0.5倍。而在分别加入Ang-Ⅱ后Flag-Septin4组MMP2蛋白表达显著低于Flag-control组,约为Flag-control的2/3。在没有加入Ang-Ⅱ时Flag-Septin4组p62蛋白显著高于Flag-control组,是Flag-control组2倍以上。加入Ang-Ⅱ后Flag-Septin4组p62蛋白表达也显著高于Flag-control组,约为Flag-control组2倍。Flag-control组HASMCs加入Ang-Ⅱ后细胞自噬标志物之一LC3-Ⅱ/GAPDH比值显著升高,约为未加药的2倍。加入Ang-Ⅱ后,Flag-Septin4组LC3-Ⅱ/GAPDH比值显著低于Flag-control组,不到Flag-control组1/2。进一步对比LC3-Ⅱ/I我们发现Flag-Septin4+Ang-Ⅱ组LC3-Ⅱ/I比值显著低于Flag-+control+Ang-Ⅱ组。6、CCK-8结果显示,在没有加入Ang-Ⅱ时,Flag-control、Flag-Septin4、Flag-Septin4+CQ组细胞活力呈梯度下降趋势,其中Flag-Septin4+CQ细胞活力显著低于Flag-control组。而在加入Ang-Ⅱ后,Flag-control、Flag-Septin4、Flag-Septin4+CQ组细胞活力仍然呈梯度下降趋势,其中Flag-Septin4+Ang-Ⅱ和Flag-Septin4+Ang-Ⅱ+CQ细胞活力均显著小于Flag-control+Ang-Ⅱ组,并且二者间Flag-Septin4+Ang-Ⅱ+CQ细胞活力显著小于Flag-Septin4+Ang-Ⅱ组。Transwell结果显示,在没有加入Ang-Ⅱ时,Flag-control、Flag-Septin4、Flag-Septin4+CQ组细胞迁移数量呈梯度下降趋势,其中Flag-Septin4+CQ细胞迁移数量显著低于Flag-control组。而在加入Ang-Ⅱ后,Flag-control、Flag-Septin4、Flag-Septin4+CQ组细胞迁移数量仍然呈梯度下降趋势,其中Flag-Septin4+Ang-Ⅱ和Flag-Septin4+Ang-Ⅱ+CQ细胞迁移数量均显著小于Flag-control+Ang-Ⅱ组。二者间Flag-Septin4+Ang-Ⅱ+CQ细胞迁移数量显著小于Flag-Septin4+Ang-Ⅱ组。Flag-control组HASMCs加入Ang-Ⅱ后,细胞增殖标志物PCNA蛋白表达显著升高。在加入Ang-Ⅱ后,相较Flag-control组,Flag-Septin4和Flag-Septin4+CQ的PCNA表达显著减低,二者表达均少于Flag-control组1/2。Flag-control组HASMCs加入Ang-Ⅱ后,细胞合成col-1蛋白表达显著升高,约为未加药组2倍。相较于Flag-control组,Flag-Septin4和Flag-Septin4+CQ的col-1表达显著减低,其中Flag-Septin4+Ang-Ⅱ+CQ少于Flag-control+Ang-Ⅱ组1/2。Flag-control组HASMCs加入Ang-Ⅱ后,细胞迁移标志物MMP2蛋白表达显著升高,较未加药组增加1/2。加入Ang-Ⅱ后,相较与Flag-control组,Flag-Septin4和Flag-Septin4+CQ的MMP2表达显著减低,其中Flag-Septin4+Ang-Ⅱ+CQ约为Flag-control+Ang-Ⅱ组的1/3。加入Ang-Ⅱ前后,Flag-Septin4组p62蛋白均显著高于Flag-control组。Flag-Septin4+CQ组p62显著高于Flag-Septin4。类似地,Flag-Septin4+Ang-Ⅱ+CQ组p62显著高于Flag-Septin4+Ang-Ⅱ组。加入Ang-Ⅱ前后,Flag-Septin4组LC3-Ⅱ/GAPDH比值均显著低于Flag-control组。加入CQ后,Flag-Septin4+CQ组LC3-Ⅱ/GAPDH比值显著高于Flag-Septin4组。类似地,Flag-Septin4+Ang-Ⅱ+CQ组LC3-Ⅱ/GAPDH比值显著高于Flag-Septin4+Ang-Ⅱ组。进一步对比LC3-Ⅱ/I我们发现Flag-Septin4+Ang-Ⅱ+CQ组LC3-Ⅱ/I比值显著高于Flag-Septin4+Ang-Ⅱ组7、通过蛋白质谱（mass spectrometry,MS）分析发现14种与Septin4结合的蛋白。通过文献查阅,包含（TCP-1）的分子伴侣（CCT）复合体中的CCT2（氨基酸覆盖率19.14%）可能介导了Septin4对自噬的抑制效应。结论:1、Septin4通过抑制自噬削弱了Ang-Ⅱ对VSMCs增殖和迁移能力的增强效应,进而影响血管重构;2、Septin4可能通过与CCT2结合抑制VSMCs自噬。