研究背景急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是以心律失常、疼痛、心力衰竭、休克等症状为主的缺血性心脏病,AMI病症治疗困难,医疗费用高,增加病人痛苦的同时,给家庭和社会也带来沉重的经济压力。治疗AMI的有效方法是重建缺血部位血流循环,其中溶栓治疗、冠脉介入术等方法是有效的治疗手段。然而心肌缺血后再灌注给患者带来的不是病情的好转和康复,反而加重心肌损伤。心肌缺血后再灌注阶段,多种原因造成心肌应激性损伤,包括心律失常、活性氧损伤、钙超载、炎细胞浸润等,这种在心肌缺血基础上恢复血流供应后造成的损伤称为心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)。恢复缺血区血流供应的同时减轻或避免MIRI有利于急性心肌梗死的治疗,MIRI的防治对急性心肌梗死治疗意义重大。心肌细胞能量代谢需求高,线粒体含量多,心肌缺血后多种原因造成线粒体损伤,线粒体自噬清除受损的线粒体,一方面避免了活性氧、细胞色素C等促凋亡因子释放入血,另一方面为心肌细胞能量代谢提供物质基础。然而,心肌缺血后再灌注阶段,随着血流恢复,心肌细胞氧气和营养物质供应恢复,呼吸链应激性爆发,活性氧损伤、钙超载、炎细胞浸润等均可以加重线粒体损伤,线粒体自噬被过度激活,过度激活的线粒体自噬增加心肌细胞死亡。线粒体自噬对MIRI来说是一把双刃剑,适时、适量的发生与心肌细胞生存与死亡密切相关。FUNDC1作为位于线粒体外膜的一种膜受体蛋白,在缺氧诱导的线粒体自噬中发挥重要作用,通过LIR结构域与LC3结合,促进自噬前体识别受损线粒体,介导线粒体自噬的发生。双参宁心胶囊(Shuangshen Ningxin capsule,SSNX)具有益气行血,化瘀止痛之功效,临床用以治疗气虚血瘀证的“胸痹”、“心痛”。SSNX通过抑制线粒体膜电位下降、线粒体膜通透性转换孔开放、细胞色素C的释放,促进线粒体Complex I活力,降低Ca2+诱导的线粒体肿胀速率,减轻线粒体途径凋亡,保护线粒体功能结构等防治MIRI,提示SSNX可能对线粒体自噬存在调控作用。研究发现方中29种入血活性成分,多种化学成分对自噬存在调控作用,如人参皂苷Rg1、丹酚酸B等。本文选取人参皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙素三种化学成分进行物质基础实验研究。目的及意义探索SSNX调控FUNDC1介导的线粒体自噬在MIRI中的表现及起到的作用,以期丰富SSNX防治MIRI的药理机制。明确人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B是否是SSNX调控FUNDC1介导的线粒体自噬保护大鼠MIRI的部分物质基础。尽管已有大量文献报道了很多对抗MIRI的药物,目前尚没有针对线粒体自噬防治MIRI的药物,尚无完全对抗MIRI的办法,仍需深入探索MIRI的治疗靶点和药物。近年来众多研究发现中药可以通过调控线粒体自噬防治MIRI,期望通过中药调控线粒体自噬角度揭示SSNX治疗MIRI的作用机制,为SSNX更好应用于临床提供研究证据。第一部分双参宁心胶囊保护大鼠心肌缺血再灌注损伤机制研究第一节双参宁心胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究目的探索SSNX对大鼠MIRI的保护作用。方法以SD大鼠为研究对象,实验分为双参宁心大、中、小三个剂量(180、90、45mg·kg-1)组及正常组和模型组五组,按药物剂量(正常组、模型组给予等量生理盐水)灌胃给药7d后,结扎冠状动脉左前降至,构建MIRI模型,控制结扎时间为45min,再灌时间为3h。血流动力学检测大鼠动脉舒张压和动脉收缩压,左室舒张末压、左室峰压、左室内压最大下降速率、左室内压最大上升速率等指标,观察大鼠心功能相关指标变化;血清学检测大鼠血清CK、CK-MB和LDH含量;心肌组织TTC和Evan’s Blue双染色观察大鼠心肌缺血梗死面积变化;心肌组织HE染色观察大鼠心肌组织病理形态变化。结果结果显示,模型组CK、LDH、CK-MB含量较正常组均升高;与模型组相比,SSNX各组对大鼠血清CK-MB含量均有降低作用,中剂量组大鼠血清中CK、LDH、小剂量组LDH含量降低。血流动力学结果显示,模型组较正常组HR、DBP、MAP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax 下降;与模型组相比,SSNX 各组 HR、SBP、DBP、MAP、LVSP、LVEDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax均升高。HE 染色结果显示,正常组心肌组织结构完整,心肌纤维结构正常,排列成束;模型组可见部分心肌纤维肿胀、断裂,灶状心肌细胞坏死,心外膜下中性粒细胞浸润明显;SSNX小剂量组心肌组织结构完整,存在心肌纤维肿胀,心外膜下中性粒细胞浸润明显;双参宁心大剂量组和中剂量组心肌组织结构完整,心肌纤维肿胀、心外膜下中性粒细胞浸润较模型组得到明显改善。TTC和Evan’s Blue双重染色实验结果显示,各组缺血面积与心肌总面积比值稳定在50%左右。正常组大鼠心肌未见明显白色染色区;与正常组相比,模型组白色染色区较大;SSNX中剂量组和大剂量组相似,白染区面积较模型组明显减小。小结大鼠MIRI模型稳定,SSNX对大鼠MIRI模型存在保护作用,90mg·kg-1、180mg·kg-1时保护作用显著优于45mg.kg-1。因此选择剂量90mg·kg-1进行后续作用机制研究。第二节双参宁心胶囊调控FUNDC1介导的线粒体自噬保护大鼠缺血再灌注损伤作用机制研究目的探索SSNX保护大鼠MIRI是否与调控FUNDC1介导的线粒体自噬有关。方法以SD大鼠为研究对象,实验分为双参宁心组、正常组、模型组三组,灌胃给药(正常组、模型组给予等量生理盐水)7d后,结扎冠状动脉左前降至,构建MIRI模型,控制结扎时间为45min,再灌时间为3h。宏观表征检测大鼠舌苔、脉象;血清学检测大鼠血清cTnT含量;小动物超声检测大鼠心功能各项指标;铁矾苏木素伊红染色法光镜下观察大鼠心肌组织形态学改变;Western Blot检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、cleaved caspase-3、BNIP3、NIX、FUNDC1 蛋白表达情况。结果脉搏变化表现为正常组大鼠脉象平缓有力,幅度适中,节律匀齐;与正常组比较,模型组大鼠脉搏幅度显著降低,不够流利,往来艰涩,幅度变小,节奏变快;与模型组相比,双参宁心组大鼠脉搏幅度升高、脉象缓和。正常组舌质淡红,苔薄白,模型组大鼠舌质较正常组颜色偏暗红,苔暗白,舌面R、B值均降低;双参宁心组大鼠与模型组相比舌质暗红、苔暗白均有改善,舌面R、G、B值均有升高趋势,但差异没有统计学意义。模型组大鼠血清中cTnT含量较正常组升高,双参宁心组较模型组cTnT含量降低。与正常组比较,模型组大鼠多项心脏功能指标发生变化,射血分数、短轴缩短分数降低,收缩末期内径、收缩末期体积、舒张末期内径、舒张末期体积升高;与模型组比较,双参宁心组大鼠射血分数、短轴缩短分数升高,舒张末期体积明显降低。Heidenhain染色结果显示,正常组心肌细胞内见少量点状黑灰色着色;模型组心肌细胞内可见片状黑灰色着色,累及心肌全层,肌纤维素间血管扩张,炎性细胞浸润明显;双参宁心组心肌细胞内见灶黑灰色着色,部分累及心肌全层,心肌纤维见血管扩张和炎细胞浸润得到明显改善。Western Blot检测结果显示,与正常组相比,模型组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Cleaved caspase-3、FUNDC1表达升高;与模型组比较,双参宁心组降低Cleaved caspase-3、FUNDC1的表达,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。而线粒体自噬受体蛋白NIX和BNIP3,模型组还是双参宁心组均无显著变化。小结大鼠心肌缺血后再灌注阶段线粒体自噬水平升高,可能与FUNDC1介导的线粒体自噬的激活有关,BNIP3、NIX介导的线粒体自噬没有发现激活现象。SSNX对大鼠心肌缺血后再灌注阶段心肌细胞内线粒体自噬存在抑制作用,SSNX对大鼠MIRI的保护作用可能与该抑制作用相关。进一步研究发现该抑制作用可能与抑制FUNDC1介导的线粒体自噬激活有关,而对BNIP3、NIX介导的线粒体自噬未发现调控作用。第二部分双参宁心胶囊有效成分Rg1、THP、Sal B保护H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制研究第一节Rg1、THP、SalB对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的最佳保护剂量研究目的明确人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B的适宜剂量,进行后续保护作用及机制研究。方法在对正常培养H9c2心肌细胞活性影响的实验中以H9c2心肌细胞研究对象,实验分为正常组、药物各剂量组,观察人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B对正常培养H9c2心肌细胞活性的影响。用完全DMEM培养基培养正常组;各药物组分别用含药物的完全DMEM培养基培养。细胞以1 ×105·mL-1密度接种于96孔细胞板36h后,待细胞融合达到70～80%,弃旧培养基,PBS洗孔2次之后,各组换相应培养基,37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中进行24h正常培养。药物作用24h后,采用CCK-8法检测细胞活性。在对H/R损伤H9c2心肌细胞活性影响实验中以H9c2心肌细胞为研究对象,构建H9c2心肌细胞H/R损伤模型。实验分为正常组、模型组、药物各剂量组,观察对H/R损伤H9c2心肌细胞活性的影响。用完全DMEM培养基培养正常组;用无糖无氧DMEM培养基培养模型组,缺氧复氧均不加任何药物;各药物组缺氧同时加入受试药物,其余过程同模型组。细胞以1×105·mL-1密度接种于96孔细胞板36h后,待细胞融合达到70～80%,弃旧培养基,PBS洗孔2次之后,换相应培养基,将细胞放进充入氮气的缺氧盒中密闭培养4h;缺氧结束后,每孔加入49.5g·L-1葡萄糖10μL,使葡萄糖终浓度为4.5g·L-1,37℃、5%CO2培养箱中进行2h复氧复糖培养。复氧复糖2h结束后,采用CCK-8法进行细胞活性检测。结果对正常培养H9c2心肌细胞活性影响实验结果显示,人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B分别在800μmol·L-1、180μmol·L-1、180μmol·L-1及以上浓度对正常培养心肌细胞活性有抑制作用。对H/R损伤H9c2心肌细胞活性影响研究结果显示,与正常组相比,模型组细胞活性显著下降;与模型组相比,人参皂苷Rg1三个剂量组均可显著升高细胞活性,浓度为100μmol·L-1时,细胞存活率最高;延胡索乙素浓度为45μmol·L-1时可显著升高细胞活性;丹酚酸B三个剂量组均可显著升高细胞活性,45μmol·L-1时细胞存活率最高。小结人参皂苷Rg1 100μmol·L-1、延胡索乙素45μmol·L-1、丹酚酸B 45 μtmol·L-1对H9C2心肌细胞H/R损伤保护作用较好。第二节Rg1、THP、Sal B对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用目的研究人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B对H9c2心肌细胞H/R损伤的保护作用。方法以H9c2心肌细胞H/R损伤模型为研究对象,实验分为正常组、模型组、Rg1组、THP组、SalB组。用完全DMEM培养基培养正常组;用无糖无氧DMEM培养基培养模型组,缺氧复氧均不加任何药物;各药物组缺氧同时加入受试药物,其余过程同模型组。细胞以1×105·mL-1密度接种于96孔、6孔细胞板或细胞共聚焦培养皿中36h后,待细胞融合达到70～80%,弃旧培养基,PBS洗孔两次之后,换相应培养基,将细胞放进充入氮气的缺氧盒中密闭培养4h;缺氧结束后,每孔加入49.5g·L-1葡萄糖10μL,使葡萄糖终浓度为4.5g·L-1,37℃、5%CC2培养箱中进行2h复氧复糖培养。复氧复糖2h结束后,取细胞培养上清采用微量酶标法进行LDH含量检测;取培养的细胞采用化学荧光法测量细胞ROS水平,于活细胞工作站下观察荧光强度。结果H9c2心肌细胞H/R损伤后,心肌细胞活性下降,LDH漏出量明显增加,细胞内ROS水平升高。Rg1、THP、Sal B对H/R损伤后H9c2心肌细胞LDH漏出量和ROS水平均有降低作用。小结人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B对H9c2心肌细胞H/R损伤具有保护作用。第三节Rg1、THP、Sal B调控FUNDC1介导的线粒体自噬保护H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤机制研究目的探索人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B对H9c2心肌细胞H/R损伤的保护作用是否与调控FUNDC1介导的线粒体自噬有关。方法模型建立及分组和给药方法同第二部分第二节。取复氧复糖2h后细胞,采用萤光素酶法检测细胞内ATP含量;取复氧复糖2h后的细胞,采用化学荧光法检测ΔΨm变化,并于活细胞工作站观察线粒体膜电位变化并拍照。Western blot 检测 Cleaved caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、FUNDC1蛋白表达情况。结果结果显示H/R损伤使H9c2心肌细胞ATP含量、ΔΨm显著降低;与模型组相比,Rg1组、THP组、SalB组ATP含量、ΔΨm均显著升高。模型组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值,线粒体途径凋亡蛋白Cleaved caspase-3、介导线粒体自噬的膜受体蛋白FUNDC1表达较正常组均显著增加;与模型组相比,Rg1组、THP 组、Sal B 组 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值、Cleaved caspase-3、FUNDC1 表达显著降低。小结H/R损伤使H9c2心肌细胞线粒体自噬过度激活,诱导了线粒体途径凋亡的发生,该激活作用与FUNDC1介导的线粒体自噬有关。人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B通过抑制FUNDC1介导的线粒体自噬,升高线粒体膜电位,改善细胞内能量代谢情况,发挥保护H/R损伤使H9c2心肌细胞的作用。结论SSNX通过抑制FUNDC1介导的线粒体自噬保护大鼠MIRI,人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B抑制FUNDC1介导的线粒体自噬保护H9c2心肌细胞H/R损伤。推测人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B是SSNX调控FUNDC1介导的线粒体自噬保护MIRI的物质基础。中药SSNX有望成为调控线粒体自噬对抗MIRI的有效治疗药物。