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背景胃癌（GC,gastric cancer）是全球最常见的恶性肿瘤之一,发病、死亡的比例逐年增加,这是因为胃癌起病隐袭,易于转移和复发,多数患者发现时已属于中晚期。胃癌的发病机制是一个涉及多基因、多阶段的复杂过程,是宿主遗传因素与环境因素交互作用的结果,其遗传学改变主要包括基因组不稳定、微卫星不稳定、Cp G岛甲基化等。针对胃癌发病过程中的遗传学改变,近年来已发现多种可指导胃癌患者临床预后的潜在靶点,但目前的临床试验发现只有针对HER2和VEGFR2的靶向治疗有效,胃癌的临床预后依然较差,因此深入了解胃癌相关的分子发病机制,在胃癌中找寻有潜在治疗作用的分子靶点,发现和确定新型的肿瘤分子标记对有效治疗胃癌有着极其重要的临床价值。Cl C-3（Chloride Voltage-Gated Channel 3）是近年来备受关注的氯通道蛋白家族成员之一,功能十分复杂,主要负责胞内外离子稳态调节、胞内囊泡的酸化以及细胞膜兴奋性的调节。但近年来研究发现Cl C-3氯通道蛋白与肿瘤的发生发展关系密切,在细胞凋亡、细胞周期、肿瘤耐药等方面起关键作用,但Cl C-3在消化道肿瘤尤其是胃癌中的具体作用机制尚不明确,其表达水平如何,有哪些因子参与其表达调控,Cl C-3能否成为胃癌中有潜在治疗作用的分子靶点和生物标志物,目前尚未见报道。在本研究中,我们运用Cl C-3启动子探针,在人胃癌细胞中发现并鉴定出XRCC5为Cl C-3的启动子结合蛋白,并可作为转录共激活因子调控Cl C-3的表达。XRCC5（X-Ray Repair Cross Complementing 5）是最近研究热度较高的生命周期调控蛋白之一,在DNA损伤修复和重组、染色体稳定性维持、基因表达调控中均发挥重要作用。近年来研究发现XRCC5在多种肿瘤组织中呈高表达,可参与肿瘤发生过程中的多个环节。但目前XRCC5在恶性肿瘤中的作用机制仍未深入阐明,XRCC5在胃癌细胞中是否可通过影响Cl C-3的表达,这个有可能是胃癌发病机制中的重要分子事件,进而参与胃癌的发生发展,目前尚不清楚。本研究着点于通过探讨Cl C-3在胃癌中的表达、生物学功能和相关通路,并在此基础上深入探究Cl C-3在胃癌中的基因表达调控机制及临床意义,旨在为胃癌发病机制的研究提供理论依据,从而进一步拓宽胃癌分子靶向治疗的空间。方法1、通过免疫组化和蛋白免疫印迹在人胃癌组织和人胃癌细胞系中检测Cl C-3的表达情况,利用转录组测序富集出Cl C-3在胃癌中的主要生物学功能和相关信号通路并进行验证。2、设计并合成5’端带有生物素标记的Cl C-3启动子探针,利用BSBP（Biotin-Streptavidin-Beads Pull-down）实验在胃癌细胞系中垂钓Cl C-3的启动子结合蛋白,通过蛋白质谱分析对目标蛋白进行鉴定,找出候选蛋白XRCC5,利用XRCC5特异性抗体进行pull-down及Ch IP（Chromatin Immunoprecipitation）实验验证其与Cl C-3启动子的相互作用,并在胃癌患者临床样本中分析Cl C-3和XRCC5表达的相关性和对胃癌患者临床预后的影响。3、构建慢病毒稳定敲低和过表达XRCC5的胃癌细胞系及相应的Cl C-3挽救实验细胞系、Reverse实验细胞系,通过蛋白免疫印迹、MTS细胞增殖实验、克隆形成实验、Transwell侵袭实验、划痕实验在体外研究Cl C-3的表达能否被XRCC5所调控,以及该调控机制对Cl C-3在胃癌中的主要生物学功能和相关信号通路的影响。4、在分子机制上,结合蛋白免疫印迹及实时荧光定量PCR探讨XRCC5对Cl C-3基因表达的调控方式,通过构建的各个片段的Cl C-3启动子报告基因截短质粒,结合双荧光素酶报告基因系统和Ch IP实验探讨XRCC5对Cl C-3启动子活性的影响及其具体结合位置,并在Cl C-3启动子区找出可能和XRCC5互作的转录因子,通过免疫共沉淀、pull-down、免疫荧光实验对其进行验证,探讨XRCC5和发生互作的转录因子共同调控Cl C-3表达的机制。5、在裸鼠皮下移植瘤动物模型中再次验证Cl C-3的表达和生物学功能否被XRCC5所调控,通过体内外实验共同揭示Cl C-3氯通道蛋白在胃癌中的表达及其具体的调控机制。结果1、Cl C-3在人胃癌组织及人胃癌细胞系中均呈现出过度表达的状态。Cl C-3高表达的胃癌患者肿瘤浸润深度深、淋巴结转移多、TNM分期晚、总体生存期较短。2、在胃癌细胞模型中,敲低Cl C-3能显著抑制细胞增殖及迁移,并能显著下调PI3K/AKT信号通路中P-PI3K、P-AKT的表达。3、在胃癌细胞模型中,通过BSBP垂钓和蛋白质谱分析鉴定出Cl C-3的启动子结合蛋白为XRCC5,通过pull-down和Ch IP验证XRCC5可特异性结合到Cl C-3的启动子区。4、在人胃癌临床样本中,Cl C-3和XRCC5在胃癌肿瘤组织中的表达均高于癌旁正常组织,且二者表达呈正相关;Cl C-3高表达的患者和XRCC5高表达的患者预后均较差,Cl C-3和XRCC5同时高表达的患者生存期最短,预后最差。5、在胃癌细胞模型中,敲低XRCC5能明显减弱Cl C-3的蛋白表达,并抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭及迁移能力,挽救实验显示在敲低XRCC5的细胞系中同时过表达Cl C-3可以部分恢复敲低XRCC5造成的细胞功能抑制效应。相反,过表达XRCC5能明显增强Cl C-3的蛋白表达,并促进胃癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭及迁移能力,Reverse实验显示在过表达XRCC5的细胞系中同时敲低Cl C-3可以部分逆转过表达XRCC5造成的细胞功能促进效应。6、在胃癌细胞模型中,Ch IP实验发现,敲低XRCC5可以抑制XRCC5和Cl C-3启动子DNA的结合,双荧光素酶报告基因实验发现,敲低XRCC5可以降低Cl C-3启动子片段-248+266,-538+266片段的双荧光素酶的活性。此外,敲低XRCC5可以明显降低Cl C-3的m RNA表达水平,过表达XRCC5可以明显增加Cl C-3的m RNA表达水平,敲低XRCC5可以显著下调Cl C-3下游的PI3K/AKT信号通路中P-PI3K、P-AKT的表达。7、在胃癌细胞模型中,分析鉴定出在细胞核中和XRCC5特异性结合的候选蛋白为转录因子PARP1,免疫共沉淀证明XRCC5与PARP1发生相互作用。通过pull-down实验证实PARP1也可特异性结合到Cl C-3的DNA启动子区,免疫荧光证实XRCC5和PARP1在胃癌细胞的细胞核中存在明显共定位。且在XRCC5过表达的细胞系中同时敲低PARP-1可以部分逆转过表达XRCC5造成的Cl C-3表达增加和细胞功能促进效应。8、在裸鼠动物模型中,敲低XRCC5能明显抑制胃癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力,瘤体的体积显著减小,重量明显减轻,瘤体切片中Cl C-3和XRCC5的表达均明显下降;过表达XRCC5能明显促进胃癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力,瘤体的体积显著增大,重量明显增加,瘤体切片中Cl C-3和XRCC5的表达均明显上升,在过表达XRCC5的情况下同时敲低Cl C-3可以部分逆转过表达XRCC5造成的Cl C-3表达增加及体内功能促进效应。结论1、Cl C-3的过表达是胃癌患者预后不佳的生物标志。2、Cl C-3在胃癌中主要生物学功能是参与细胞增殖和细胞迁移,PI3K/AKT信号通路可能是其下游主要信号通路。3、Cl C-3在胃癌中的表达和功能在体内外均受XRCC5调控。4、XRCC5作为转录共激活因子,与转录因子PARP1相互作用并形成转录调控复合体结合在Cl C-3启动子区上,通过影响Cl C-3的启动子活性,在转录水平上调控Cl C-3的表达。5、Cl C-3和XRCC5均是评估胃癌患者总生存率及预后的独立因素,双靶向Cl C-3和XRCC5可能有潜在的临床诊断治疗作用。