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生物钟对于生物有效地适应地球上环境的变化具有重要意义。粗糙脉孢菌是研究生物钟的理想模式生物之一。生物钟基因周期性的激活和抑制是生物钟正常运转的必要条件。在粗糙脉孢菌生物钟核心振荡器中,生物钟基因frequency(frq)的周期性表达包括转录激活与转录抑制。已有的研究表明,frq基因的周期性激活依赖于转录激活因子WHITE COLLAR复合体(WCC),而该复合体的转录活性又受进入细胞核的生物钟蛋白FRQ的反馈抑制。目前,人们对frq基因的转录激活机制已有很多了解,但对frq基因的转录抑制方式却知之甚少。我们猜测粗糙脉孢菌中还可能存在除FRQ蛋白之外的转录抑制因子参与frq基因的转录抑制。为了探究frq基因转录的抑制机制,我们首先对可能的frq基因的转录抑制因子进行遗传筛选。我们发现转录共抑制因子RCO-1参与frq基因的转录抑制。在rco-1缺失突变体中,生物钟基因frq的nRNA;水平明显升高,而且其昼夜节律丧失。rco-1we双突变体中存在大量frq mRNA,说明RCO-1抑制不依赖WC复合体的frq转录。进一步的研究发现RCO-1对于维持frq基因区域染色质结构十分重要。遗传分析显示组蛋白甲基转移酶set-2或染色质重塑因子chd-1缺失也导致frq基因的转录不再依赖WC复合体。这些研究结果表明RCO-1通过SET-2和CHD-1来影响frq基因区域的染色质结构,从而共同调控不依赖WC复合体的frq基因的转录。在rco-1缺失突变体中,持续表达的不依赖WC复合体的FRQ蛋白通过介导蛋白激酶CKⅠ和CKⅡ对WC-1和WC-2蛋白的磷酸化使其丧失转录激活作用,从而干扰了生物钟负反馈调控环路的正常运转。为了进一步研究不依赖WC复合体的frq转录调控机制,我们构建了wc与已知参与调控生物钟组分的双突变体,并进行双突变体表型分析。我们发现依赖于cAMP的蛋白激酶PKA的调节亚基MCB的突变,也会导致frq基因的转录不再依赖WC复合体。遗传和生化实验结果证明PKA活性升高会诱导不依赖WC复合体的frq转录。体外和体内的磷酸化实验均证明RCM-1是PKA的底物。蛋白纯化实验表明RCM-1蛋白可以与RCO-1形成复合体,并参与抑制不依赖WC复合体的frq转录。模拟RCM-1蛋白的磷酸化状态直接导致不依赖WC复合体的frq基因转录以及分生孢子生物钟节律的紊乱。更重要的是RCM-1蛋白能在frq基因区域富集,并且其富集水平受到PKA活性的影响。以上结果证明PKA通过磷酸化RCM-1蛋白,促使其从frq基因区域染色质上解离,从而解除RCM-1-RCO-1复合体对不依赖于WC复合体的frq基因的抑制作用。我们的研究不仅解析了生物钟基因frq的转录调控机制,还阐明了PKA通过磷酸化RCM-1-RCO-1复合体来调控其转录抑制活性的机制。本研究将促进我们对frq基因转录调控的进一步理解,并对其它物种中的相关研究具有指导意义。