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研究背景卵巢癌发病率为妇科恶性肿瘤第三位,但因其发病隐匿,往往70%左右的患者就诊时就已为III/IV期,5年生存率仅约30～40%,故死亡率居首位。卵巢癌标准的治疗方案为手术加化疗,而目前一线的化疗方案为铂类药物联合紫杉醇。虽然大部分患者在初始治疗时即取得较好的疾病缓解,但仍有部分患者对一线化疗无反应或反应较差。近年来,随着对肿瘤认知的加深以及患者对化疗药物反应的迥异,肿瘤个体化治疗随之提出。目前针对肿瘤个体化治疗的方法多种多样,其中一种方式为人体外化疗药敏实验,虽然目前体外药敏试验取得一定效果,但是与临床的符合度仍有待进一步提高。随着对肿瘤研究的深入,肿瘤微环境逐渐进入人们视野,而其中肿瘤微环境的一大特点即为乏氧。大量的体外实验已经证实,乏氧环境下可引发肿瘤的血管生成、抗凋亡、药物敏感性改变以及肿瘤转移。目前化疗药物敏感实验均基于常氧条件下进行,因此有学者指出药敏试验与实际临床效果不符合原因可能与未能较好模拟肿瘤乏氧微环境有关。故利用肿瘤细胞进行体外化疗药物敏感性实验时,如能同时模拟肿瘤微环境中的缺氧状态,或许能够更好的拟合体内化疗药物杀伤肿瘤细胞的效果。研究目的1、明确常氧环境和乏氧环境下卵巢癌肿瘤细胞的敏感化疗药物是否存在差异,初步探索基于乏氧环境下药物敏感性实验筛选的方法,为今后建立基于乏氧环境下敏感性化疗药物筛选的研究提供一定基础。2、探索常氧环境和乏氧环境下卵巢癌细胞转录组水平变化情况。研究方法1、将2%O2+93%N2+5%CO2的混合气体充入乏氧培养模块进行体外模拟乏氧环境,而常氧环境则为21%O2+74%N2+5%CO2。利用ROS-ID?Hypoxia/Oxidative Stress Detection Kit（乏氧探针）进行SKOV3细胞的乏氧状态判定,利用CCK-8对两种氧气环境中SKOV3细胞进行细胞活力检测并绘制生长曲线。2、构建两种乏氧处理方法作为乏氧条件下药物敏感性筛选实验的备选方案,方案一为直接乏氧法（顺铂与乏氧同时作用于SKOV3细胞72小时）,方案二则为乏氧过渡法（乏氧预处理24小时后,加入顺铂于乏氧条件下培养72小时）,同时设立两种乏氧处理方法所对应的常氧处理组。利用CCK-8检测各实验组中顺铂的杀伤效果并绘制抑制率曲线,能够导致顺铂杀伤效果显著低于常氧处理组的乏氧处理方法即为后续乏氧条件下药物敏感性筛选的实验方案。3、根据选择的乏氧条件下药物敏感性筛选的实验方案对SKOV3细胞进行常用的一线及二线化疗药物进行筛选,同时设立对应的常氧处理组,利用CCK-8评估化疗药物的杀伤效果并对比乏氧环境下及常氧环境下化疗药物的抑制率有何不同,根据计算的IC50及IC90判定在乏氧环境下及常氧环境下的敏感药物。4、将常氧环境及乏氧环境下生长72小时的SKOV3细胞交由第三方检测公司进行全转录组测序,测序结果返回后,利用Dr.TOM平台进行差异表达基因分析,分别选取5个高表达及低表达基因进行RT-q PCR数据验证,验证无误后利用DAVID在线数据库进行GO及KEGG分析。5、应用SPSS 24进行统计学分析（P＜0.05认为具有统计学差异）,利用R4.0.1及Graph Pad Prism 8.0.1进行图像绘制。研究结果1、当氧气浓度为2%时,乏氧探针红色荧光明显强于21%氧气浓度下培养的SKOV3细胞,表明2%氧气浓度可诱导SKOV3处于乏氧状态;相对于21%氧气浓度下培养者,SKOV3在2%的氧气环境中生长速度减缓。2、直接乏氧法中顺铂在两种氧环境下对卵巢癌细胞的杀伤效果无显著差异,乏氧过渡法中顺铂在两种氧环境下杀伤效果存在显著差异（P＜0.05）,因此后续乏氧环境下的抗卵巢癌敏感药物筛选实验选用乏氧过渡法进行。3、根据IC50及IC90判定在常氧条件下SKOV3对顺铂、卡铂、紫杉醇、多柔比星、吉西他滨、依托泊苷、米托蒽醌敏感,对洛铂、拓扑替康耐药;而乏氧条件下SKOV3对紫杉醇、多柔比星、吉西他滨、米托蒽醌为敏感,对卡铂、顺铂、洛铂、拓扑替康、依托泊苷耐药。4、相对于常氧条件下培养者,乏氧培养72小时后的SKOV3细胞共有10653个基因发生表达改变,其中1645个显著差异表达基因表达水平改变超过4倍以上。显著差异表达基因中有999个的表达水平上调改变,而646个呈表达下调改变。5、GO分析结果表明,上调基因参与的生物学过程主要富集于经典糖酵解、血管生成正性调节、血管生成乏氧反应等生物学过程;下调基因则富集于以DNA为模板的转录调节、纤毛形成、DNA损伤刺激的细胞反应、磷脂酰肌醇生物合成过程、正向调节上皮细胞凋亡过程等生物学功能。6、KEGG分析结果表明,上调基因主要富集于PI3K-AKT信号通路、ECM-受体相互作用、HIF-1信号通路等信号通路,而下调基因则主要富集于肿瘤胆碱代谢、氨基酸生物合成等信号通路。研究结论1、乏氧条件下敏感性化疗药物与常氧条件下筛选的敏感性化疗药物不同,为进一步探索乏氧条件下药物敏感性筛选方法提供一定理论依据。2、乏氧可调节SKOV3细胞基因转录水平,其变化与乏氧适应、转移、耐药相关。