【摘 要】
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代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）是最常见的慢性肝病之一,其发病机制与脂质代谢紊乱、氧化应激、细胞凋亡等密不可分。线粒体是细胞能量代谢的主要场所,参与调节细胞生长、氧化磷酸化和脂质代谢等生理过程,因此其功能障碍可促进细胞内脂质异常蓄积,诱发MAFLD发展进程中氧化应激、炎症、细胞凋亡等事件发生,是脂肪肝向脂肪性肝炎（NASH）转化的关键所在。Micro RNAs（miRNAs）是细胞内参与调节多种信
【机 构】
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中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【出 处】
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中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
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代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）是最常见的慢性肝病之一,其发病机制与脂质代谢紊乱、氧化应激、细胞凋亡等密不可分。线粒体是细胞能量代谢的主要场所,参与调节细胞生长、氧化磷酸化和脂质代谢等生理过程,因此其功能障碍可促进细胞内脂质异常蓄积,诱发MAFLD发展进程中氧化应激、炎症、细胞凋亡等事件发生,是脂肪肝向脂肪性肝炎（NASH）转化的关键所在。Micro RNAs（miRNAs）是细胞内参与调节多种信号通路的内源性非编码RNA,有些miRNAs已被发现可以通过靶向单个或多个线粒体蛋白或线粒体相关因子调节线粒体功能,从而缓解或加重MAFLD相关病理变化。鉴于miRNAs类药物具有多靶点、内源性等特点,在针对发病机制复杂的慢性病治疗方面具有一定的优势,而且随着小核酸药物的逐渐兴起,因此开发调控线粒体功能的miRNAs类药物用于MAFLD治疗具有重要的应用价值。调控线粒体功能的miRNAs的体外筛选:实验室在前期研究中,采用棕榈酸（PA）诱导肝细胞（L02）损伤的细胞模型,并在GEO临床数据中分析获得的差异表达miRNAs中筛选出54个对活性氧（ROS）有调控作用的miRNAs。在此基础上,本研究继续进行可调控线粒体功能的miRNAs的筛选与评价。由于JNK信号通路作为ROS诱导的线粒体功能紊乱和内质网应激的下游分子事件,连接了线粒体损伤和肝细胞凋亡/炎症,因此我们首先在PA诱导的L02细胞模型中,筛选出14个可调控p-JNK水平的miRNAs。随后分别从线粒体氧化磷酸化能力、线粒体膜电位极化、线粒体DNA含量三个方面评价了这些miRNAs对线粒体功能的影响。最终发现:（1）miR-337-3p和miR-675-3p可以降低PA刺激的p-JNK水平,而miR-337-3p可恢复受损的线粒体DNA含量的减少,miR-675-3p可恢复线粒体氧化磷酸化能力和膜电位极化;（2）miR-612和miR-15a-3p可以增加PA刺激的p-JNK水平,加重线粒体氧化磷酸化能力的下降和线粒体DNA含量的减少。MiRNAs调控线粒体功能相关效应的体外评价:接着,本研究对miR-337-3p、miR-675-3p、miR-15a-3p和miR-612这4个miRNAs进行了线粒体功能相关效应的评价。首先分析了这4个miRNAs在临床数据库的表达情况,结果表明这4个miRNAs在MAFLD的发病进程中存在差异性表达,具有继续开发的意义:与健康组相比,miR-337-3p、miR-675-3p和miR-15a-3p的表达水平在脂肪肝组呈现下调;与脂肪肝组相比,miR-15a-3p和miR-612的表达水平在NASH组明显上调。之后,以PARP剪切体和抗凋亡蛋白Bcl-2作为细胞凋亡的指标、以IL-6和IL-1β作为炎症作用的指标、以油红O染色作为脂质蓄积的指标评价了这4个miRNAs对线粒体功能相关效应的作用。最终发现:（1）miR-337-3p可以抑制PA诱导的肝细胞凋亡;（2）miR-15a-3p和miR-612可以加重PA诱导的肝细胞凋亡、炎症作用和脂质蓄积。MiR-337-3p的体内和体外生物学活性评价:鉴于miR-337-3p在细胞上显示出明显的保护作用,因此,本研究首先通过CRISPR/Cas9系统特异性敲除L02细胞中的内源性miR-337-3p,检测miR-337-3p对线粒体功能和MAFLD的作用。结果表明:miR-337-3p-/-可以加重线粒体氧化磷酸化能力的下降、细胞凋亡和脂质蓄积。随后,基于实验室前期腺相关病毒递送miR-337-3p对高脂高果糖高胆固醇（HFHFr HC）饮食诱导小鼠的实验结果,本研究采用PEG-P（DTCco-TMC）-PEI1200纳米囊泡递送miR-337-3p,开展其体内药效学评价。通过对包裹在纳米囊泡中miR-337-3p的浓度和时间梯度进行优化,确定了1.5 mg/kg的给药浓度,皮下注射每7天1次的递送条件。随后在HFHFr HC饮食诱导16周的小鼠模型中给予miR-337-3p,持续给药12次后,检测了miR-337-3p对MAFLD病理特征的影响。结果显示:（1）与空载体组相比,miR-337-3p在肝脏中含量可达约300倍;（2）miR-337-3p的已报道的靶基因STAT3的蛋白和m RNA水平略下降;（3）在给药第4周和9周时,血清中果糖胺显著降低,这与之前基于腺相关病毒递送miR-337-3p的结果一致。这些结果说明纳米囊泡可以将miR-337-3p递送到肝脏发挥部分作用,但同时也显示出一定的肝毒性,可能是没有观察到终点药效学的原因之一,该问题需要进一步研究解决。综上,本课题从临床差异的miRNAs出发,筛选获得对MAFLD中线粒体功能具有保护作用的miR-337-3p、miR-675-3p和可以加重MAFLD中线粒体损伤的miR-612、miR-15a-3p,且它们的生物学活性与临床相关性具有对应性,这为MAFLD小核酸药物开发提供了新的候选靶点或活性分子。
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