金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）是一种革兰阳性菌,常寄生在皮肤和粘膜的表面,可引起全身多部位的多种感染。金葡菌是引起院内感染和社区感染的重要病原菌之一,对医疗保健系统造成严重负担。近年来,随着抗生素的大量使用及滥用,细菌耐药情况不断加重,金葡菌的预防和治疗也愈发困难。耐甲氧西林金葡菌是一种公认的“超级细菌”,其能够抵抗大部分青霉素类抗生素,严重限制了临床药物的使用。目前研究表明,金葡菌丙酮酸羧化酶基因（pycA）的突变导致细菌的致病力显著降低,暗示着丙酮酸羧化酶可作为一个抗金葡菌感染的潜在靶点。本课题通过转座子随机插入突变筛选了可影响pycA表达的基因,并探究了pycA的遗传调控及其与金葡菌致病能力的关系。主要研究结果如下:一、通过转座子随机插入突变,发现金葡菌中有89个基因可影响pycA的表达;其中,正调控pycA的基因79个,负调控pycA的基因10个。pycA突变体具有天冬氨酸营养缺陷表型;由此,对79个pycA正调控基因的突变株进行表型分析,发现顺乌头酸酶（Cit B）和异柠檬酸脱氢酶（Cit C）基因（编码三羧酸循环中的关键酶）的转座子插入突变也可引起金葡菌产生天冬氨酸营养缺陷表型。通过基因定向敲除,分别构建了顺乌头酸酶基因（citB）和异柠檬酸脱氢酶基因（citC）的基因缺失突变体;与转座子插入突变体类似,这两个基因缺失突变体（（?）citB和（?）citC）均具有天冬氨酸营养缺陷表型。在（?）citB或（?）citC中组成型表达pycA可导致突变体部分丧失其天冬氨酸营养缺陷表型。通过功能互补实验,证明了citB和citC的缺失突变均可引起金葡菌对大蜡螟幼虫的感染能力显著降低。二、通过利用细菌生理生化、生物化学、生长曲线分析和大蜡螟幼虫感染等实验发现:1)较之于野生型,（?）citB和（?）citC中柠檬酸水平显著升高;在citB或citC缺失突变的基础上进一步缺失柠檬酸合成酶基因citZ（即细菌无法累积柠檬酸）,所获得的双基因缺失突变体（（?）citB（?）citZ或（?）citZC）不具有天冬氨酸营养缺陷表型,而且其致病能力恢复至野生型水平;2)类似地,在citB或citC缺失突变的基础上进一步缺失ccp E基因（编码响应柠檬酸的转录调控因子Ccp E）后,细菌的天冬氨酸营养缺陷表型消失,而相应的pycA表达恢复到野生型水平;此外,双基因缺失突变体（（?）citB（?）ccp E或（?）citC（?）ccp E）的致病能力较（?）citB或（?）citC突变体有提高;3)在体外,纯化的Ccp E蛋白可直接与pycA启动子相结合。基于实验结果提出以下假设:在金黄色葡萄球菌中,citB或citC的缺失突变引起柠檬酸累积及相应的Ccp E蛋白激活,抑制了pycA的表达和天冬氨酸的合成,进而导致细菌致病能力降低。三、通过纸片扩散法筛选获得40个可引起金葡菌产生天冬氨酸营养缺陷表型的化合物;发现人源Cit C抑制剂DS-1001b和BAY-1436032可引起野生型JE2菌株产生较弱的天冬氨酸营养缺陷以及pycA表达的减少。这些研究结果为利用小分子化合物抑制金葡菌的致病能力提供了研究基础。