芳香族污染物(aromatic pollution,AP)一直是环境污染防治领域的研究热点与难点,建立一种安全有效的代谢调控机制,用于检测环境中芳香族污染物的残留量具有重要的现实意义。DntR来源于原核生物中的Burkho Lderia sp.菌株,是和2,4-二硝基甲苯降解有关的一种调控基因,可以在水杨酸存在的情况下激活PDNT启动子,启动DNT降解途径下游基因表达。微生物代谢芳香族污染物的过程中大多数通过生成中间代谢物-邻苯二酚,再进行后续降解。而邻苯二酚与水杨酸结构类似,通过改造DntR研制邻苯二酚生物感应分子,可用于检测工业处理污水的排放及污染物的环境残留量,还可应用于AP降解关键酶基因定向进化的高通量筛选。构建以p RB1k-DntR-gfp为载体的全细胞生物效应器,其具有转录调控基因DntR及位于PDNT启动子下游的报告基因gfp;该效应器受外界诱导物诱导,可将不可观察的基因传递信号转化成可被检测的荧光信号。通过对DntR-Salicylate共结晶蛋白结构的结合口袋进行分析,最终选取DntR上L151,L153,H206和I230四个位点进行四点饱和突变,并利用Mega Whop全质粒PCR扩增的方式构建了容量达106的突变体文库。以gfp为报告基因,结合流式细胞仪分选的高通量筛选方法,我们成功筛选得到一例邻苯二酚生物感应分子-正向突变体C5-5,其与WT DntR相比,响应邻苯二酚的荧光信号比值提升了1.6倍;此突变体响应邻苯二酚的最低浓度低至10μM。通过比对分析突变体C5-5和野生型的氨基酸序列,结果显示产生的突变位点与预期一致,分别为L151I,L153P,H206T,I230T。以1utb作为模板,利用Pymo L替换突变位点得到突变体C5-5的模拟结构,再与小分子物质邻苯二酚借助Auto Dock进行构效关系分析,结果显示:突变体的氨基酸极性增强且氨基酸间的自由能变化正值变大;上述变化,促使羧基基团的氧原子与水分子中的氢原子形成氢键,增大了诱导物-DNA结合腔的口径,更利于诱导物进入。