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草鱼是我国主要的淡水养殖鱼类之一，在草鱼养殖的特定阶段以蚕豆为单一饵料源投喂120天，使其肉质变硬变脆，脆化养殖成功的草鱼被称为“脆肉鲩”。草鱼脆化后肉质的硬度、弹性、咀嚼性和胶原蛋白含量等均显著增强，研究认为这些肉质特性改变和肌肉胶原蛋白含量紧密相关。在肌肉组织中，胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，存在于肌纤维间的结缔组织中。Ⅰ型胶原是胶原蛋白的主要类型，推测Ⅰ型胶原的变化可能在草鱼脆化过程中起到重要作用。在哺乳动物的研究中已经证明TGF-β/Smads信号通路是调控Ⅰ型胶原表达的主要途径，而针对处于TGF-β信号通路的中枢环节的Smad4构建反义载体阻断信号转导是研究TGF-β/Smads信号通路有效手段。本团队前期发现蚕豆上调了草鱼肌肉中I型胶原表达，为了探索蚕豆是否基于TGF-β/Smads信号通路增加草鱼肌肉I型胶原，本实验首次克隆了草鱼Smad4基因cDNA全序列并构建反义Smad4真核表达载体pcDNA3.1(+)-AntiSmad4，检测了蚕豆投喂草鱼120天过程中Ⅰ型胶原α1、Ⅰ型胶原α2、TGF-β1、Smad2和Smad4等5个基因的mRNA和蛋白表达水平的变化，利用反义Smad4真核表达载体注射于脆化草鱼背部肌肉中，检测Smad4蛋白表达变化和Ⅰ型胶原α1及Ⅰ型胶原α2的mRNA表达与蛋白表达水平变化。实验基本情况如下：1.为了研究TGF-β/Smads信号通路在蚕豆调控草鱼(Ctenopharyngodonidellus) Ⅰ型胶原过程中的作用，本实验克隆了处于TGF-β/Smads信号通路中中枢环节的Smad4基因cDNA全序列。分析得出Smad4核酸序列长度为2974bp，其中开放阅读框1644bp，编码547个氨基酸。生物信息学分析结果显示草鱼Smad4蛋白相对分子质量为59690.3，分子式为C2632H4073N753O791S24，理论等电点为6.5，属于疏水性蛋白。Smad4蛋白总体结构分为MH1和MH2两个高度保守的功能结构域和中间的链接区域，二级结构显示含有5个α螺旋结构和12个β-折叠结构域，其他为无规则卷曲。BLAST相似性分析显示，草鱼Smad4蛋白的氨基酸序列与鲤鱼、斑马鱼的相似性较高，分别为94.23%和92.97%。另外，本文将草鱼Smad4基因的开放阅读框片段反向插入表达载体pcDNA3.1(+)成功构建了反义Smad4基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-AntiSmad4，为后续的阻断TGF-β/Smads信号通路后Ⅰ型胶原变化的研究奠定了基础。2.为了探索蚕豆是否基于TGF-β/Smads信号通路增加草鱼肌肉I型胶原,本实验以浸泡过的蚕豆投喂草鱼120d，并于0d、30d、60d、90d、120d时采取草鱼背部肌肉样品，测定Ⅰ型胶原α1和α2以及信号通路关键蛋白TGF-β1、Smad2、Smad4的蛋白表达水平和mRNA表达水平。实验结果显示，Ⅰ型胶原α1、α2蛋白表达水平在0d、30d、60d、90d、120d逐渐增加，TGF-β/Smads通路关键蛋白TGF-β1、Smad2、Smad4的蛋白表达水平在整个脆化过程也随着时间推移呈递增的趋势；Ⅰ型胶原α1、α2的mRNA表达水平在30d和60d时变化不显著(P>0.05)，在90d、120d时表达量急剧增加，差异显著(P<0.05）；TGF-β1和Smad2的mRNA表达量均呈现先增后降的趋势(P<0.05)，60d时表达量在最高；Smad4mRNA表达量仅除了在30d时显著增加(P<0.05)。实验结果表明，随着投喂蚕豆时间的延长，脆化草鱼肌肉中I型胶原和TGF-β/Smads通路的信号强度均逐渐增加，TGF-β/Smads信号通路在蚕豆增加草鱼肌肉I型胶原中起到了重要作用。3.为研究阻断TGF-β/Smads信号通路后脆化草鱼肌肉I型胶原的表达变化，本实验将已构建的反义Smad4基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-AntiSmad4注射到摄食蚕豆120天的脆化草鱼背部肌肉中，注射量为1ml，浓度200ng/μl，然后于注射后0d、1d、2d、5d、10d、15d、20d时采集背部肌肉样品以检测Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。利用Western blot技术检测肌肉中Smad4、Ⅰ型胶原α1和α2的蛋白表达水平，通过荧光定量PCR技术检测Ⅰ型胶原α1和α2的mRNA表达水平。结果显示肌肉注射后，Smad4蛋白表达水平在第2d开始下调，第10d达到最低，15d后表达量上调；Ⅰ型胶原α1和α2的蛋白表达变化趋势一致，注射后1d开始下调，5d达到最低，而15d后蛋白表达量开始上调；Ⅰ型胶原α1和α2的mRNA表达水平在注射后无显著变化，15d后表达量增加。本部分实验进一步证实了基于反义载体干扰TGF-β/Smads信号转导通路后，脆化草鱼肌肉中Ⅰ型胶原蛋白的表达量显著下降。总之，本研究证实了TGF-β/Smads信号通路是蚕豆调控草鱼肌肉中Ⅰ型胶原表达的途径之一，投喂蚕豆能通过增强TGF-β信号转导，增加草鱼肌肉Ⅰ型胶原蛋白含量。