[研究背景]解剖学研究发现走行于颞骨部的面神经由于通过坚硬狭窄的骨性面神经管,在损伤后水肿缺血不能及时缓解,最终导致变性坏死,出现不同程度的面神经瘫痪。由于目前缺乏理想的治疗手段,所以研究面神经水肿发生机制,找到水肿损伤形成和持续的方法,避免面神经进一步变性坏死是面神经损伤治疗的方向之一。水通道蛋白(AQPs)是一类高效介导跨膜水转运的特异性通道蛋白,在水液代谢的调节中起重要作用,参与人体多种组织器官水肿的形成和消除。前期通过动物面神经损伤模型的研究,AQP1在面神经组织上表达趋势与神经水肿程度相似,且主要定位于雪旺氏细胞上,调控其表达可调节雪旺氏细胞的肿胀程度。根据研究报道乙酰唑胺能有效抑制AQP1的表达,我们也在前期工作中证实乙酰唑胺对雪旺氏细胞表达有负性调节作用。但是对于AQP1在雪旺氏细胞和面神经水肿形成过程中的表达调控机制,目前尚无研究报道。由于目前缺乏从整体水平对AQPs的功能及其表达调控机制进行研究,因此,结合前期研究基础,本课题通过对雪旺氏细胞水肿模型和面神经损伤动物模型的研究,运用细胞生物学、分子生物学等实验方法分别在体外和体内研究水肿状态下AQP1的表达调控机制及乙酰唑胺干预条件下对AQP1的调控机制,并探讨其相互之间的关系,为治疗早期面神经水肿提供全新的方向。[目的]1、研究AQP1表达变化与雪旺氏细胞水肿的关系及其表达调控机制;2、研究乙酰唑胺对AQP1表达调控与雪旺氏细胞水肿之间的关系;3、在面神经损伤动物模型上进一步验证调控AQP1表达导致面神经水肿的相关机制,为临床以水通道蛋白为靶点预防或治疗早期面神经水肿提供新思路。[方法]一、渗透压改变对雪旺氏细胞AQP1表达的影响及其表达调控的实验研究1、低渗液对大鼠雪旺氏细胞生物学特性及AQP1表达变化的影响A. RSC96大鼠雪旺氏细胞系培养及鉴定(1)细胞贴壁培养,细胞形态观察;(2)免疫荧光双标染色:S-100 (雪旺氏细胞特异性标志物)及AQP1表达;(3)蛋白质印迹法检测雪旺氏细胞中AQP1表达。B.构建低渗细胞水肿模型(1) 2组低渗液240mmol/L、150 mmol/L诱导细胞水肿;(2) CCK-8细胞活力检测及流式细胞早期凋亡评估模型标准及时间点;(3)低渗诱导细胞水肿形态变化及confocal动态监测细胞体积变化;(4)免疫荧光及Western-blot检测细胞水肿AQP1表达变化。2、渗透压改变对雪旺氏细胞MAPK信号通路的影响(1)复制细胞水肿模型;(2)细胞水肿模型分组:2组低渗液240mmol/L、150mmol/L,对照组以常规无血清DMEM培养;(3) Westem-blot检测MAPK各亚组蛋白磷酸化水平变化。3、MAPK在雪旺氏细胞水肿中对AQP1表达调控的实验研究(1)复制细胞水肿模型;(2)细胞水肿模型分组:ERK/p38组;对照组,模型组,抑制剂干预组,干预组将待处理细胞预先加入MAPK特异性抑制剂作用1h后,再加入低渗液体;(3) Western-blot 检测 AQP1 表达变化。二、乙酰唑胺对大鼠雪旺氏细胞AQP1表达调控的初步研究1、慢病毒介导的AQP1过表达对大鼠雪旺氏细胞生物学特性影响的实验研究(1)AQP1过表达构建:将目的基因克隆到慢病毒载体,鉴定克隆正确连接(PCR和测序),过表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,慢病毒转染雪旺氏细胞制备AQP1过表达稳转株模型;(2)细胞周期测定过表达细胞与阴性对照细胞差异;(3)免疫荧光半定量及蛋白质印迹法检测感染后雪旺氏细胞AQP1蛋白表达变化。2、乙酰唑胺AZA抑制AQP1表达与MAPK信号级联之间的实验研究(1)利用CCK-8检测乙酰唑胺对雪旺氏细胞毒性,筛选合适的药物浓度;(2)不同浓度梯度的AZA作用于过表达稳转株(OE),Westem-blot检测干预12h后AQP1蛋白变化情况;(3) AZA干预AQP1过表达稳转株后,免疫印迹法观察0-12h MAPK蛋白磷酸化变化水平;(4)细胞分为正常对照组,乙酰唑胺抑制组,乙酰唑胺抑制干预组,干预组将待处理细胞预先加入MAPK特异性抑制剂作用1h后,再加入乙酰唑胺干预12h,观察AQP1蛋白变化情况。3、AZA对AQP1表达变化的穿梭机制研究(1)利用构建的OE进行免疫沉淀(IP),将沉淀的蛋白液行质谱分析,筛选可能与AQP1互相作用的细胞骨架蛋白(MYH14)及泛素蛋白(Ub);利用免疫荧光共标染色验证AQP1与MYH14、Ub细胞内共定位;重复IP试验,验证乙酰唑胺干预下AQP1与MYH14的相互作用;(2) AZA干预OE12h,利用膜蛋白提取试剂盒提取细胞膜及细胞浆蛋白,免疫印迹法观察AZA干预后A.QP1转位表达情况;(3) MYH14-shRNA质粒构建与转染:将目的基因克隆到慢病毒载体,鉴定克隆正确连接(PCR和测序),质粒转染雪旺氏细胞,构建的MYH14-shRNA利用免疫荧光观察转染效率,免疫印迹验证MYH14蛋白敲除水平;(4) MYH14-shRNA对细胞活力影响及泛素化抑制剂MG132药物浓度行CCK-8检测;(5)细胞分为正常对照组,AZA抑制组,AZA抑制干预组,干预组将待处理细胞预先敲除MYH14,再加入AZA,观察AQP1蛋白转位变化情况;(6)细胞分组正常对照组,乙酰唑胺抑制组,泛素抑制剂组、泛素抑制剂+乙酰唑胺干预组,干预组将待处理细胞预先MG132处理1h,再加入AZA,观察AQP1蛋白变化情况。三、AQP1在面神经水肿中的表达调控及治疗机制的实验研究1、大鼠面神经损伤模型的构建及评估(1)耳后切口入路构建大鼠面神经损伤模型:Wistar大鼠左侧:手术侧,右侧:自身对照侧;术后14天,对面神经核团区的脑干部位连续冰冻切片,对核团神经元计数;对面神经功能评分;(2)解剖获取面神经颞骨段面神经组织进行组织切片,免疫组化观察AQP1的分布和表达,判断AQP1的时相性变化;(3)免疫印迹法对颞骨段面神经组织内的AQP1蛋白的表达进行检测,验证AQP1蛋白水平的时相性变化趋势;2、面神经损伤对大鼠面神经组织MAPK信号通路的影响(1)重复构建动物模型,免疫印迹法检测面神经水肿形成时间内MAPK蛋白磷酸化变化情况;(2)动物模型分组,MAPK抑制剂筛选浓度验证体内ERK/p38抑制水平;3、MAPK在面神经水肿中对AQP1表达调控的实验研究动物模型分为ERK/p38两组:正常对照组,模型组,模型干预组,抑制剂空白对照组,干预组及抑制剂空白对照组术前给予预实验中摸索的药物浓度及给药方式,手术造模,免疫印迹法观察AQP1蛋白变化情况;四、数据统计学分析获得结果,为后续研究开辟思路。[结果]1、RSC96大鼠雪旺氏细胞表达AQP1,在不同渗透压诱导下,细胞水肿形成,AQP1 均于 6h 达高峰(150mM: P<0.001,240mM: P<0.01);2、不同浓度的低渗溶液作用后均能激活p-ERK和p-p38蛋白磷酸化水平;150mmol/L组:p-ERK在30min时表达最强(P<0.001),p-p38在1h时表达最强(P<0.001); 240mmol/L 组:p-ERK 在 15min 时达最强(P<0.001),p-p38 在 5min时达最强(P<0.001)。ERK抑制剂U0126中,两组低渗浓度组AQP1表达较低渗刺激组均明显降低(150mmol/L: P<0.05; 240mmol/L: P<0.001),与对照组无明显统计学差异;p38抑制剂SB203580组AQP1蛋白表达较低渗处理降低(150mmol/L: P<0.05; 240mmol/L: P<0.001),但仍高于正常对照组水平(P<0.01 )。3、构建的AQP1过表达载体测序正确,转染雪旺氏细胞后AQP1蛋白表达明显增加(P<0.001);乙酰唑胺干预12h后,蛋白水平明显降低(10-5mol/L:P<0.001,10-6mol/L: P<0.01),AQP1 下调呈浓度依赖性(10-5:1 0-6mol/L: P<0.05);4、乙酰唑胺干预细胞0-12h, p-ERK磷酸化水平6h表达最强(P<0.001 )。ERK抑制剂U0126作用于细胞后,能明显阻断乙酰唑胺对AQP1的抑制作用(P<0.05);5、MYH14-shRNA质粒测序正确,转染雪旺氏细胞后MYH14蛋白水平下降(P<0.01),并对雪旺氏细胞活力无影响;6、乙酰唑胺干预细胞后,激活MAPK信号通路,下游细胞骨架蛋白MYH14与AQP1相互作用,从细胞浆向细胞膜转位,1h时表达量最高(P<0.01),MYH14-shRNA转染细胞后,AQP1转位现象消失,膜AQP1表达下调(P<0.05);7、细胞预处理MG132,泛素蛋白酶体通路被抑制,AZA对AQP1抑制作用消失(P<0.001),证明AZA通过AQP1转位在细胞膜上激活泛素通路而降解;8、大鼠面神经损伤行为学观察,面神经功能评分均符合面瘫指标,面神经核团计数低于对照侧(P<0.05);免疫组化及免疫印迹分析均在术后7dAQP1表达最高(P<0.001);9、面神经损伤后大鼠体内激活ERK/p38信号通路,p-ERK/p-p38均在术后3d时达最强(P<0.001),ERK抑制剂U0126,抑制剂干预组AQP1表达模型组降低(P<0.001),与对照组无明显统计学差异;p38抑制剂SB203580组AQP1蛋白表达较模型组降低(P<0.001),结论同细胞学水平类似,说明MAPK信号通路有可能参与面神经水肿形成中对AQP1表达调控。[结论]1、AQP1参与雪旺氏细胞水肿形成;2、MAPK在低渗诱导细胞水肿形成中参与AQP1的表达调控;3、乙酰唑胺在细胞内通过穿梭机制及泛素蛋白酶体通路完成对AQP1的表达调控;4、MAPK可能在大鼠面神经水肿形成中参与AQP1的表达调控。