【摘 要】
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目的:2,2’,4,4’-四溴联苯醚（2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether,PBDE-47）可引起以行为和认知功能损害为主的神经毒性,但其毒性作用机制目前尚未完全阐明。本研究拟在前期研究发现PBDE-47神经毒性与其引起的自噬异常有关的基础上,进一步探讨PBDE-47对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞自噬过程中自噬体与溶酶体融合的影响,以及调节自噬和溶酶体生物合
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目的:2,2’,4,4’-四溴联苯醚（2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether,PBDE-47）可引起以行为和认知功能损害为主的神经毒性,但其毒性作用机制目前尚未完全阐明。本研究拟在前期研究发现PBDE-47神经毒性与其引起的自噬异常有关的基础上,进一步探讨PBDE-47对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞自噬过程中自噬体与溶酶体融合的影响,以及调节自噬和溶酶体生物合成的转录因子EB（transcription factor EB,TFEB）在此过程中所扮演的角色,从而为进一步研究PBDE-47神经毒性的机制及预防提供科学证据和理论依据。方法:不同浓度PBDE-47（1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）处理PC12细胞24 h后,透射电子显微镜观察细胞内自噬溶酶体的形态和数量;利用Alexa Fluor 488绿色荧光标记微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）、Alexa Fluor 594红色荧光标记溶酶体相关膜蛋白1（lysosomal associated membrane protein 1,LAMP1）后,采用激光共聚焦显微镜观察二者共定位的黄色荧光斑点评估自噬体与溶酶体的融合情况;Western blot方法检测自噬体与溶酶体融合关键蛋白突触融合蛋白17（syntaxin 17,STX17）、突触体相关蛋白29（synaptosomal-associated protein 29,SNAP29）、囊泡相关膜蛋白8（vesicle-associated membrane protein 8,VAMP8）,调控自噬体与溶酶体融合核心因子STX17-SNAP29-VAMP8复合物的自噬相关蛋白14（autophagy-related gene 14,ATG14）和Ras相关蛋白7（Ras-related protein 7,Rab7）,以及TFEB蛋白的表达水平。为了验证TFEB在PBDE-47致PC12细胞自噬体与溶酶体融合过程中的作用,用TFEB过表达腺病毒转染24 h后,Western blot方法检测STX17、SNAP29、VAMP8、ATG14、Rab7的蛋白表达水平变化情况;利用可指示细胞自噬状态的腺病毒Ad-mCherry-GFP-LC3B转染细胞后,采用激光共聚焦显微镜观察自噬体与溶酶体融合的变化情况;采用免疫荧光共定位法用激光共聚焦显微镜观察LC3与LAMP1共定位的变化情况;以及采用透射电子显微镜观察细胞内自噬溶酶体的形态和数量的变化情况。结果:透射电子显微镜下观察到对照组细胞内有大量自噬溶酶体,自噬溶酶体形态未见异常改变,1μmol/L PBDE-47染毒组自噬溶酶体形态和数量与对照组类似,但10μmol/L PBDE-47染毒组细胞内自噬溶酶体的数量明显减少,20μmol/L PBDE-47染毒组细胞内自噬溶酶体数量进一步减少,且其体积增大。免疫荧光共定位结果显示,随着PBDE-47染毒剂量的升高,胞质内标记LC3的绿色荧光斑点增加,标记LC3与LAMP1共定位的黄色荧光斑点减少。Western blot结果显示,与对照组相比,10μmol/L和20μmol/L PBDE-47染毒组STX17、SNAP29、VAMP8、Rab7以及TFEB的蛋白表达水平均显著下降（P＜0.05）;1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L PBDE-47染毒组ATG14的蛋白表达水平均显著低于对照组（P＜0.05）。TFEB腺病毒转染24 h后,Western blot结果显示,与腺病毒空载+PBDE-47染毒组相比,TFEB过表达+PBDE-47染毒组SNAP29、VAMP8、ATG14和Rab7蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）;Ad-mCherry-GFP-LC3B转染与免疫荧光共定位结果也发现,与腺病毒空载+PBDE-47染毒组相比,TFEB过表达+PBDE-47染毒组指示自噬体与溶酶体融合受阻的自噬体黄色荧光斑点减少;且LC3与LAMP1共定位的黄色荧光斑点增强。同时,透射电子显微镜也显示,与腺病毒空载+PBDE-47染毒组相比,TFEB过表达+PBDE-47染毒组自噬溶酶体数量增多,体积恢复正常。结论:一定剂量的PBDE-47可抑制PC12细胞自噬体与溶酶体融合相关蛋白和TFEB的表达水平,从而抑制自噬体与溶酶体的融合过程,致使自噬溶酶体数量减少和功能受损。TFEB过表达可通过增加自噬体与溶酶体融合相关蛋白表达水平来缓解PBDE-47导致的自噬体与溶酶体融合障碍,增加自噬溶酶体数量和改善其功能。
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