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[目的]探讨人体外周血树突状细胞在体外培养诱导其成熟的方法,通过得到成熟的细胞培养技术,对树突状细胞功能的研究奠定实验基础。[方法]抽取空腹、健康成人外周血细胞,肝素抗凝,将细胞生理盐水稀释,加入淋巴细胞分离液离心分层,取第二层单个核层细胞层,37℃5%CO2培养箱中孵育2.5h,获取贴壁的单个核细胞层,经含rhGM-CSF (100ng/ml), rhIL-4(50ng/ml)的用RPMI-1640完全培养基孵育1天后,即得到未成熟的树突状细胞,用脂多糖(LPS)诱导产生成熟的树突状细胞。通过流式细胞仪分析树突状细胞表现变化、倒置显微镜及电镜观察细胞形态改变、共聚焦显微镜观察细胞抗原吞噬能力,对外周血树突状细胞进行鉴[结果]从形态、表型、功能上分析,可得到具有典型特性的树突状细胞,倒置显微镜下及电镜下可观察到树突状细胞形态不规则,并向周围形成辐射状树突样突起。流式细胞检测树突状细胞CD11c、CD83、CD80、CD86及HLA-DR的表面标志物表达,在逐渐成熟过程中,表达逐渐增高。共聚焦显微镜下,未成熟树突状细胞表现对抗原吞噬能力的增加,成熟树突状细胞则表现对抗原摄取能力下降。[结论]通过对细胞的分离,提纯、刺激、诱导,可观察到树突状细胞由未成熟到成熟的过程,未成熟树突状细胞在7天内,通过细胞因子及LPS刺激,可分化、诱导使其成熟,细胞在成熟过程中,细胞表型、结构、功能在不断产生变化,其形态与功能相适应。树突状细胞由未成熟到成熟过程的变化,具体体现在：1.树突状细胞分出大量向外生长的突起2.树突状细胞抗原吞噬能力减弱3.树突状细胞共刺激分子CD80、CD86、CD83表达增强,HMC-Ⅱ类分子HLA-DR表达增强4.树突状细胞CDllc表面标志物,在树突状细胞成熟前后无明显变化,但持续处于高表达状态。[目的]探讨免疫抑制剂他克莫司对外周血树突状细胞的成熟能力的影响,为临床器官移植患者长期使用他克莫司而出现免疫耐受提供理论支持。[方法]一、人体外周血树突状细胞的提取、分离、纯化,对在24孔培养板中培养的树突状细胞进行分组：A组：树突状细胞培养第一天加入FK-506(10ng/ml), B组：树突状细胞培养第一天加入FK-506(10ng/ml),细胞结束前24小时加入1ulLPS (1000ng/ml), C组：树突状细胞培养结束前24小时加入1μLPS (1000ng/ml), D:不加FK-506及LPS,作为空白对照组二、FK-506对人体外周血树突状细胞表型的影响7天后收集培养、诱导完全的树突状细胞,制成细胞悬液,加入不同的荧光素.标记的单克隆抗体,避光反应20min,洗涤,使用流式细胞检测。三、FK-506对外周血树突状细胞细胞因子(IL-12)分泌的影响使用ELISA检测A、B、C、D组细胞培养第7天经离心分离的上清液,检测IL-12细胞因子水平。四、混合淋巴细胞反应检测外周血树突状细胞刺激同种T细胞增殖能力。对外周血单个核细胞进行分离、纯化,在37℃5%C02培养箱中孵育2.5h,获取未贴壁的单个核细胞层,即获得同种异体淋巴细胞,将树突状细胞行密度分层,在96孔板中,1X103/孔,2X103/孔,4X103/孔,设置3个复孔,将淋巴细胞与树突状细胞共培养,4天后对将培养板离心、收集培养上清,加入噻唑蓝(MTT)溶液,培养箱中孵育4小时,再向每孔加入15μl二甲亚枫(DMSO),酶联免疫检测仪测定490nm处光密度(OD)。五、FK-506对人体外周血树突状细胞抗原吞噬、摄取能力的影响。收集第六天培养的树突状细胞,加入FITC-OVA抗原荧光素,37℃C5%CO2培养箱中孵育1天,共聚焦显微镜下观察树突状细胞抗原吞噬能力。将培养7天的树突状细胞加入FITC-OVA后37℃5%CO2培养箱中孵育1天,流式细胞检测树突状细胞摄取OVA阳性率。[结果]一、FK-506对人体外周血树突状细胞表型的影响FK-506能抑制树突状细胞共刺激分子CDllc、CD80的表达,A、B组CDllc阳性表达率分别为37.7±0.6%,35.6±0.7%分别于C组比较(阳性表达率66.1±2.4%),有统计学意义(P<0.05),而共刺激分子CD86、CD83及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR的表达却无明显改变(P>0.05)。二、FK-506对外周血树突状细胞细胞因子分泌的影响FK-506能抑制树突状细胞分泌IL-12,A、B组分泌IL-12水平为26.5±1.3pg/ml、28.1±1.23pg/ml,与C组(26.1±3.4pg/ml)比较,有明显差异(P<0.05),提示FK-506对树突状细胞细胞因子IL-12的分泌有明显抑制作用。三、混合淋巴细胞反应检测外周血树突状细胞刺激同种T细胞增殖能力。FK-506能抑制树突状细胞对同种异体T细胞的增殖,测量MLR后的OD值,对△OD值进行比较,A、B组在反应细胞：刺激细胞=20：1时,AOD分别为0.061±0.034、0.068+0.029,与C组比较(0.115±0.056),有明显差别(P<0.05),并且在反应细胞：刺激细胞=40：1时,A、B组△OD分别为0.03±0.025、0.013±0.011,与C组比较(0.058±0.015),有明显区别(P<0.05)四、FK-506对树突状细胞抗原吞噬能力的影响。共聚焦显微镜下观察第6天的树突状细胞,加入FK-506的细胞与未加F-506的细胞对抗原的摄取在形态上无明显差别。而培养第7天的细胞,加入抗原后,流式检测A、B组阳性细胞表达率为74.2±6.8%、71.7±±3.6%,与C组比较(45.8±2.6),有明显差别(P<0.06),提示FK-506能增强树突状细胞抗原摄取能力,且与加入LPS无关(A组与B组无明显差异(P>0.05))。[结论]免疫抑制剂FK-506对人体外周血树突状细胞具有抑制其成熟功能,能使树突状细胞维持在未成熟状态,树突状细胞保持其抗原吞噬、摄取能力,以及分泌细胞因子水平明显下降,有大量研究报道,FK-506对树突细胞成熟的影响有多方面因素,肝移植患者长期运用FK-506,导致树突状细胞停留在未成熟状态,可能是导致肝移植患者出现免疫耐受重要机制之一,F-506影响树突状细胞细胞成熟表现如下；1.形态上改变不明显。2.细胞表面标志物CDllc、CD80表达下调。3.细胞共刺激分子CD86及MHC-II类分子HLA-DR的表达无明显影响。4.细胞因子IL-12分泌量减少。5.抑制同种T淋巴细胞增殖。6.能增强树突状细胞抗原吞噬、摄取能力,但抗原递呈能力减弱。