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1目的在新安医学“脾虚致痹”理论指导下,分析、总结强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)活动期患者中医学病机,应用数据挖掘及关联规则分析健脾化湿、清热通络法对AS患者免疫炎症指标及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的影响,从临床研究与体外实验两个方面观察AS活动期患者氧化应激(Oxidative Stress,OS)、细胞因子、AMPK-FOXO3a信号通路相关指标的变化,及中药黄芩清热除痹胶囊(Huangqin Qingre Chubi Capsule,HQC)对其影响,探讨HQC改善AS活动期患者OS作用机制。2方法2.1数据挖掘研究对安徽省中医院风湿科2012年6月至2016年6月AS住院患者的病历资料进行回顾性研究。对所用中药通过复杂网络图分析核心处方,SPSS 21.0和SPSS Clementine 12.0对中药性味归经频数、关联规则分析,并运用关联规则、随机行走模型评价中医药治疗对免疫炎症指标及SOD的影响。2.2临床实验研究将AS活动期患者随机分为治疗组和对照组各30例。治疗组服用黄芩清热除痹胶囊(HQC)+芙蓉膏外敷,HQC每日3次,每次3粒,连续服用12周;对照组服用柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SASP)+芙蓉膏外敷,每次4片,每天2次,疗程同治疗组。另设30例健康组来自健康志愿者。采用ELISA法(enzyme-linked immunosorbent method)检测患者外周血血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α),白介素(interleukin,IL)1β,IL-10,IL-4,SOD,总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAOC),丙二醇(Malondialdehyde,MDA),脂质过氧化产物(Lipid peroxidation,LPO),过氧化体增殖物激活型受体γ(peroxi some proliferator-activated receptor gamma,PPARγ),单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK),叉头转录因子O3a(forkhead class box O3a,FOXO3a),锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)、CD36。采用流式细胞术检测CD36表达。采用实时荧光定量(real-time fluorescence quantitative PCR,Q-PCR)检测PPARγ、AMPK-ɑ、FOXO3a mRNA变化。采用蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)检测PPARγ、AMPK-ɑ、FOXO3a,P-FOXO3a,Mn SOD蛋白表达。仪器法测定血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR),全自动生化分析仪检测超敏C反应蛋白(high sensitivity C-Reactive Protein,hs-CRP),问卷量表观察AS患者临床症状体征。采用SPSS 21.0统计软件分析,比较两组治疗后的疗效及治疗前后相关指标变化情况。2.3体外实验研究从AS患者外周血中分离出单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),分为模型组、抑制剂(Compound C)组、HQC+Compound C组、HQC组(最佳浓度组)体外培养,对照组来源于健康人外周血分离的PBMCs。采用ELISA法检测PBMCs培养液上清中IL-1β,IL-4,SOD,TAOC,MDA,LPO表达。采用Q-PCR法检测AMPK-ɑ、FOXO3a、Mn SOD mRNA变化。采用WB法检测AMPK-ɑ、P-AMPK-ɑ、FOXO3a,P-FOXO3a,Mn SOD蛋白表达。采用SPSS21.0统计软件分析。3结果3.1数据挖掘研究结果3.1.1 AS活动期患者SOD变化及相关性分析与正常范围[(129-216)mmol/L]相比,在248例AS患者中,SOD比正常范围低的共有132例,占53.23%,SOD与血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、超敏C反应蛋白(high sensitive C-reactive protein,hs-CRP)、免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,Ig A)、补体C3、C4成负相关(P<0.05);3.1.2我院风湿科治疗AS活动期患者用药分析对处方进行分析,核心处方为:薏苡仁、狗脊、陈皮、杜仲、甘草、茯苓、威灵仙、桃仁、丹参、蒲公英、白花蛇舌草、泽泻、山药、红花、豨莶草,其中以健脾化湿药使用最多,药物以归脾经为主,健脾化湿药分别与活血化瘀药、清热解毒药、祛风除湿药配伍关联度高(置信度为95.78%、95.24%、94.50%)。3.1.3中药与免疫炎症指标关联规则分析单味中药黄芩与hs-CRP、ESR、C4下降关联度高(置信度为78%、86.49%、87.5%),知母与Ig G、Ig M下降关联度较高(置信度为85.71%、70.59%);中药黄芩配伍丹参、山药分别与hs-CRP、C4下降关联度较高(置信度为79.17%、90%),桃仁配伍黄柏与ESR下降关联度较高(置信度为87.18%),独活配伍豨莶草与白细胞计数(White blood cell count,WBC)下降关联度较高(置信度为75.44%),知母配伍茯苓、杜仲分别与免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,Ig G)、免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,Ig M)关联度较高(置信度分别为90%、81.82%)。3.1.4中药与SOD的关联规则分析与SOD关联度最高的5味中药分别为:薏苡仁、独活、山药、威灵仙、豨莶草(置信度分别为92.31%、90%、84.62%、82.5%、81.82%);与SOD关联度最高的5个药对分别为:薏苡仁配伍山药、独活配伍豨莶草、薏苡仁配伍杜仲、薏苡仁配伍威灵仙、山药配伍独活(置信度分别为100%、100%、95%、94.73%、91.30%)。3.1.5 hs-CRP、ESR的随机行走模型评价研究组hs-CRP正向增长率、综合改善率、好转或改善系数分别为:0.2804、28.04%、0.49;ESR正向增长率、综合改善率、好转或改善系数分别为:0.2519、25.19%、0.44,均高于对照组。3.2临床实验研究结果3.2.1 AS患者氧化应激、细胞因子的变化共检测60例AS患者与30例健康人外周血氧化应激相关指标,与正常组相比,AS组TAOC、SOD、IL-4、IL-10水平明显降低,MDA、LPO、TNF-ɑ、IL-1β水平明显升高(P<0.05)。3.2.2 AS患者AMPK-FOXO3a信号通路的相关指标表达的变化共检测60例AS患者与30例健康人AMPK-FOXO3a信号通路相关指标,与正常组相比,AS组PPAR-γ、AMPK、FOXO3a、P-FOXO3a、Mn SOD水平明显降低(P<0.05);与正常组相比,AS组PPAR-γ、AMPK-ɑ、FOXO3amRNA表达明显降低(P<0.05);与正常组相比,AS组PPARγ、AMPK-ɑ、FOXO3a,P-FOXO3a,Mn SOD蛋白表达明显降低(P<0.05)。3.2.3 AS患者CD36表达的变化共检测60例AS患者与30例健康人CD36的变化,与正常组相比,AS组CD36水平明显降低(P<0.05)。3.2.4 AS患者氧化应激指标相关性分析AS组SOD与BASDAI、BAS-G、VAS、ESR、hs-CRP、TNF-a评分成负相关,与IL-4、PPAR-γ、FOXO3a、Mn-SOD成正相关;TAOC与TNF-a、BASDAI、BAS-G、VAS、ESR成负相关,与AMPK、CD36成正相关;LPO与IL-10、P-FOXO3a、CD36成负相关,与IL-1β成正相关;MDA与IL-4、PPAR-γ、P-FOXO3a成负相关,与BASDAI、VAS、ESR、hs-CRP、TNF-a、IL-1β成正相关。(P<0.05)3.2.5 HQC治疗AS患者的临床疗效黄芩清热除痹胶囊可显著降低AS患者BASDAI、BASFI、BAS-G、BASMI、VAS、ESR、CRP。治疗组ASAS20、BASDAI50达标率分别为83.33%(25/30)、80.00%(24/30),BASDAI50显著高于对照组(P<0.05)。3.2.6 HQC对AS患者氧化应激、细胞因子的影响与治疗前相比,治疗组TAOC、SOD、IL-4、IL-10明显升高,MDA、LPO、TNF-ɑ、IL-1β明显降低(P<0.05),与对照组相比,治疗组的SOD、IL-10明显升高,MDA显著降低(P<0.05)。3.2.7 HQC对AS患者AMPK-FOXO3a信号通路相关表达的影响与治疗前相比,治疗组PPAR-γ、AMPK、FOXO3a、P-FOXO3a、Mn-SOD均明显升高(P<0.05),与对照组相比,治疗组P-FOXO3a、Mn-SOD显著升高(P<0.05);与治疗前相比,治疗组PPAR-γ、AMPK-ɑ、FOXO3a mRNA表达明显升高(P<0.05);与治疗前相比,治疗组PPARγ、AMPK-ɑ、FOXO3a,P-FOXO3a,Mn SOD蛋白表达明显降低(P<0.05)。3.2.7 HQC对AS患者CD36表达的影响与治疗前相比,治疗组CD36均明显升高(P<0.05),与对照组相比差异不明显(P>0.05);3.3体外实验研究结果3.3.1 HQC含药血清对AS外周血单核细胞中氧化应激、细胞因子表达的影响与正常组相比,模型组单核细胞中IL-1β,MDA、LPO明显升高,IL-4、SOD、TAOC明显降低(P<0.01);与模型组相比,Compound C组IL-1β,MDA、LPO明显升高,IL-4、SOD、TAOC明显降低(P<0.05);与模型组相比,Compound C+HQC含药血清组IL-1β,MDA、LPO明显降低,IL-4、SOD、TAOC明显升高(P<0.01);与模型组相比,HQC组IL-1β,MDA、LPO明显降低,IL-4、SOD、TAOC明显升高(P<0.01).3.3.2 HQC含药血清对AS外周血单核细胞中AMPK-FOXO3amRNA表达的影响与正常组相比,模型组单核细胞中AMPK、FOXO3a、Mn SOD mRNA表达水平明显降低(P<0.01);与模型组相比,AMPK、FOXO3a、Mn SOD mRNA在Compound C组明显降低(P<0.05);与模型组相比,AMPK、FOXO3a、Mn SOD mRNA在HQC组均明显升高(P<0.01)。3.3.3 HQC含药血清对AS外周血单核细胞中AMPK-FOXO3a蛋白表达的影响与正常组相比,模型组AMPK、P-AMPK、FOXO3a、P-FOXO3a、Mn SOD蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与模型组相比,AMPK、P-AMPK、FOXO3a、P-FOXO3a、Mn SOD蛋白在Compound C组明显降低(P<0.01);与模型组相比,AMPK、P-AMPK、FOXO3a、P-FOXO3a、Mn SOD蛋白在HQC组均明显升高(P<0.05)。4结论4.1数据挖掘研究我院风湿科治疗AS活动期患者以从脾论治为主,配伍祛风湿、清热解毒、活血化瘀等药物的配方原则,且清热药黄芩与hs-CRP、ESR,健脾化湿药薏苡仁与SOD有较高的关联度,中药内服联合芙蓉膏外敷与hs-CRP、ESR存在长程关联,优于单纯中药内服。4.2 AS活动期患者存在氧化应激损伤4.2.1 AS活动期患者氧化应激损伤特点AS活动期患者氧化损害标志物MDA、LPO水平明显升高,TAOC、SOD等抗氧化酶水平明显降低。4.2.2 AMPK-FOXO3a信号通路被抑制,导致AS氧化应激损伤当AMPK-FOXO3a信号通路被抑制时,FOXO3a的磷酸化水平降低,Fox O3a上的核定位信号被隐藏,其转录活性受到抑制,从而诱导活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累和细胞的凋亡,增加氧化应激损伤。4.3 HQC对AS活动期患者的疗效HQC能够减少AS活动期患者氧化应激损伤,改善患者临床症状和实验室指标,且BASDAI50达标率高于对照组。4.4 HQC改善AS活动期患者氧化应激损伤的机制4.4.1 HQC通过上调抑炎细胞因子(如IL-4、IL-10)、下调促炎细胞因子(如IL-1β、TNF-α),控制炎症反应,恢复机体氧化-抗氧化的平衡,从而改善临床症状;4.4.2 HQC通过激活PPARγ调节CD36的表达,改善氧化应激及炎症反应,改善患者临床症状;4.4.3 HQC通过激活PPARγ,从而活化AMPK-FOXO3a信号通路,提高抗氧化能力,从而改善氧化应激及炎症反应,从而改善临床症状。