研究目的:随着全球人口老龄化和人群平均寿命的延长,心房颤动简称房颤（atrial fibrillation,AF）的患病率在逐年增加,有统计显示2019年全球房颤的患病率要比1989年翻一番,达到了惊人的5970万。与房颤发病率增加的危险因素包括年龄的增长、心血管疾病、超重和肥胖、饮酒、阻塞性睡眠呼吸暂停、高血压、糖尿病、冠状动脉疾病、心力衰竭和慢性肾病。房颤危害巨大,由于心房的不规律颤动引起的血流动力学变化和血液高凝状态所导致的脑卒中、心力衰竭甚至猝死等严重不良并发症给家庭和社会造成了十分沉重的经济负担。目前对房颤的治疗管理侧重于减轻症状和预防并发症。心率控制和节律控制用于改善症状,抗凝用于降低卒中风险。然而,上述治疗经常伴有潜在的不良反应,治疗效果不能满足医患双方的需要。房颤的机制包括触发和维持机制。触发机制主要是肌袖病灶内异常电活动驱动房颤形成。维持机制很复杂,在维持因素中左心房电生理和结构重构起着重要作用。正是因为维持机制的相对复杂才导致持续性房颤消融成功率低且复发率高。而导致上述治疗受限的主要原因可能是对房颤发病机制了解的不够充分。结构重构的主要表现是心肌纤维化,而心房肌纤维化是房颤发生和维持的最关键底物之一。心房纤维化的细胞和分子机制调控是非常复杂的,最重要的挑战是利用这些机制在临床转化方面的巨大潜力,以新的生物标志物阐明个体AF患者潜在的病理生理学机制,这对探究防治房颤纤维化的新方法意义重大。非编码RNA（ncRNA）在过去因为其不编码蛋白质的特性而被视为“垃圾RNA”,但最近因其在发育、细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤发生中的重要作用而备受关注。近年来,非编码RNA已经成为心血管系统疾病的热门话题。它参与心肌梗塞、动脉粥样硬化、血栓形成、纤维化和炎症等病理生理过程,是心血管疾病的新危险标志物。长链非编码RNA（lncRNA）是一组长度大于200个碱基的nc RNA,已经被发现可以在表观遗传水平、转录及转录后调节水平等多个层面调节基因表达,并且在癌症、阿尔茨海默病和心血管疾病中发挥重要的作用。然而与其他心血管疾病（如心力衰竭和动脉粥样硬化）相比,对AF中Lnc RNA的研究较少。本项研究以构建左心房快速起搏电刺激诱导兔房颤模型为基础,根据本课题组高通量测序检测房颤患者和非房颤患者左心耳中lncRNA的差异表达转录本,并通过生物信息学、保守性和实验验证等方法挑选与房颤心房纤维化相关的lncRNA。通过调控lncRNA的功能等方法研究目标lncRNA在房颤兔模型纤维化发生中的作用。并在分子机制层面说明目标lncRNA对房颤纤维化的影响。探索参与AF发病机制的lncRNA,以期将lncRNA的临床前发现转化为AF管理治疗的临床实践,为房颤的诊断和预后发现生物标志物和治疗靶点。研究方法:第一部分:本部分研究通过左心房快速起搏电刺激诱导实验兔心房颤动,采用两种不同的电刺激频率来评估手术造模成功率、模型兔对实验的耐受性、房颤的诱发率以及房颤的诱发时间。应用彩色多普勒超声检测兔左心房前后经、左心房容积和左心房射血分数等指标来评估模型兔左心房功能。应用Masson染色评估不同刺激组下左心房纤维化的程度,应用Image J软件对Masson染色做半定量分析。采用SPSS25.0统计软件,各组数据均用（?）±s表示,造模前与造模后的比较采用t检验,组间的比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。第二部分:本部分研究通过对北部战区总医院心外科退行性瓣膜病伴/不伴持续性房颤患者,于瓣膜手术中废弃的左心耳组织,房颤组3例,非房颤组3例,TRIzol法提取其中RNA后进行高通量测序,检测基因转录本和lncRNA的表达,观察其中是否有变化。q RT-PCR对差异lncRNA进行验证,与测序结果比对,同时进行Gene Ontology（GO）富集分析;根据基因测序和GO富集的结果挑选合适的lncRNA。应用测序lncRNA转录本和已知兔基因库进行双向BLAST比对,寻找保守性高的兔lncRNA。应用第一部分探索到的合适的刺激强度构建左心房快速起搏电刺激模型兔,并分为电刺激组和假手术组,电刺激组刺激电极缝合方法与刺激方法同第一部分间断刺激组,假手术组于同样位置缝合刺激电极但不起搏。刺激期间观察是否出现自发性AF,如果出现则刺激终止,否则刺激直至4周满。所有组于手术后4周处死,留取心房组织分别放置于-80℃冻存备用,另一部分4%多聚甲醛浸泡固定。将选取出的兔lncRNA应用q RT-PCR的方法在RAP兔房颤模型左心耳组织中进行验证。根据上述结果筛选出最终的lncRNA进行下一步研究。体外构建lncRNA对照腺相关病毒,lncRNA XR＿001793654.1的过表达腺相关病毒,病毒滴度为2.1*10^12vg/m L。将12只雄性成年新西兰大耳兔随机分成XR＿001793654.1过表达组和对照组。同时构建左心房快速起搏电刺激兔房颤模型,并将对应的腺相关病毒在左心房肌中多点斜行注射感染,建模4周后处死留取左心房组织备用,通过冰冻切片观察荧光强度、q RT-PCR检测XR＿001793654.1在两组中的表达量来检测病毒感染效率。同时应用彩色多普勒超声评估左心房功能,Masson染色评估心房纤维化程度来验证XR＿001793654.1对房颤左心房纤维化的影响。第三部分:本部分研究基于第二部分筛选的XR＿001793654.1,通过生物信息学和数据库分析,发现ocu-miR-107可能于之相互作用,而miR-107-3p的靶基因可能是KLF13。根据上述预想设计双荧光素酶检测实验,构建XR＿001793654.1基因的DNA片段、miR-107-3p的靶基因KLF13的3’UTR DNA片段野生型,同时合成其突变型DNA片段后构建荧光素酶载体,应用双荧光素酶检测实验检测ocu-miR-107与载体结合后的荧光强度,用于验证KLF13基因是否为ocu-miR-107的靶基因、XR＿001793654.1能否与ocu-miR-107之间存在相互作用。同时构建ocu-miR-107的过表达和沉默腺相关病毒、阴性对照腺相关病毒。将18只成年新西兰大耳兔随机分为XR＿001793654.1过表达阴性对照组、XR＿001793654.1过表达组、ocu-miR-107过表达组,ocu-miR-107过表达对照组、ocu-miR-107沉默组、ocu-miR-107沉默对照组、XR＿001793654.1过表达和ocu-miR-107过表达腺相关病毒共同感染组,构建模型和病毒感染及检测指标同第二部分。用q RT-PCR实验分别在房颤/非房颤患者左心耳组织中检测has-miR-107的表达量;在RAP兔房颤模型电刺激组/假手术组中检测ocu-miR-107的表达量;通过彩色多普勒超声、Masson染色方式评价ocu-miR-107对房颤模型兔心房纤维化的作用及左心房功能的影响。免疫组化和Western Blotting对预测的靶蛋白KLF13在人和兔的组织中进行验证,确定其表达水平与房颤纤维化的相关性以及XR＿001793654.1能否与ocu-miR-107相互作用从而影响KLF13的表达进而在房颤纤维化的发生发展中起到作用。研究结果:第一部分:1、植入子植入模型兔体内工作期间,植入子工作良好,刺激前P波、QRS波群、T波均清晰,基线稳定。术后恢复72小时开启程序刺激（连续刺激组刺激电压2000m V,刺激脉宽1ms.间隔刺激组刺激电压2000m V,刺激脉宽1ms,刺激周期50ms,刺激2s,暂停2s）,刺激后兔模型心率明显加快,停止刺激后缓慢下降,说明刺激有效。在实验周期内模型兔均保持清醒,可以于笼内自由活动,饮食饮水睡眠等生活习惯与术前相比无明显变化。2、两组刺激模式下造模成功率无统计学差异P＞0.05,两组术后3天存活率无统计学差异,连续刺激组有4只于2周后出现持续性房颤,房颤时间＞48h,间隔刺激组2周内均无房颤出现,且间隔组有8只于刺激后3周左右时间出现持续性房颤,房颤时间＞48h,连续组有4只于3周-4周之间出现房颤,说明频率高的高频程序刺激在较短时间内可产生房颤（P＜0.05）,但是连续刺激组在高频刺激过程中4周内死亡率较间隔刺激组明显升高,间隔刺激组较连续刺激组耐受性明显较好（P＜0.05）。3、根据彩色多普勒超声诊断仪测量左心房数据。两组基线数据比较无统计学差异（P＞0.05）。在两组中与刺激前的基线数据相比,经过刺激后,两组LAD、LAVmax、LAVmin等指标显著增大,LAEF显著降低（P＜0.05）,可观察到明显的左房扩大与左心房功能障碍,但两组数据比较无明显差异（P＞0.05）。此结果说明,兔快速起搏诱导房颤模型可以使左心房直径与容积明显增大,并降低了LAEF。4、对两组左心房样本进行Masson染色来观察左心房心肌纤维化程度,结果发现两组心房肌组织排列紊乱纤维化明显。与正常心房组织心房肌紧密排列无纤维化改变差别明显。但两组纤维化程度无明显差别（P＞0.05）。第二部分:1、高通量测序共测得lncRNA共有18722个,其中55个转录本表达上调,11个转录本表达下调,GO富集分析差异表达的lncRNA的功能可能于房颤纤维化相关。2、将差异表达的lncRNA在同兔基因库做双向BLAST比对分析保守性,将保守性好的lncRNA分别在人和兔心房组织中验证,最后根据上述条件挑选出XR＿001793654.1作为目的lncRNA进行下一步研究。3、通过在体实验对lncRNA XR＿001793654.1功能验证,在AAV-XR＿001793654.1组与AAV-NC组中,LAD、LAVmax、LAVmin等指标增大,LAEF降低（P＜0.05）,可观察到左房扩大与左心房功能障碍;与术后4周的Sham组相比较,AAV-XR＿00179654.1组的LAD、LAVmax、LAVmin等指标均显著增加,LAEF显著降低（P＜0.05）;与刺激4周后的AAV-NC组相比较,AAV＿00179654.1组的LAD、LAVmax、LAVmin等指标显著降低,LAEF显著升高（P＜0.05）;由此结果说明,XR＿001793654.1的过表达可减轻RAP引起的左房直径与容积的扩大,减轻LAEF的降低,有效调节左房扩大与功能障碍。对AAV-XR＿001793654.1组和AAV-NC组左心房样本进行Masson染色,发现AAV-XR＿001793654.1组的心房纤维化程度较AAV-NC组明显减轻（P＜0.01）。第三部分:1、根据生物信息学分析,lncRNA XR＿001793654.1与ocu-miR-107存在多个结合位点。与非房颤患者相比,has-miR-107在房颤患者的左心耳组织中表达量上调与lncRNA ENST00000623312相比呈明显负相关,R~2=0.8961,P＜0.05。同时,对lncRNA XR＿001793654.1和ocu-miR-107在RAP兔房颤模型左心房中的表达量行相关性分析,XR＿001793654.1与miR-107-3p的表达量呈负相关。在RAP兔房颤模型中感染XR＿001793654.1过表达腺相关病毒后,q RT-PCR显示miR-107-3p的表达量与AAV-NC组相比是下调的,P＜0.05,这个结果证实了XR＿001793645.1和miR-107-3p在房颤左心耳组织中的表达呈负相关关系。然后,我们通过序列对比和生物信息学分析,发现XR＿001793654.1和ocu-miR-107之间存在相互作用的潜在结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果显示:与阴性对照组相比,ocu-miR-107序列与XR＿001793654.1片段野生型结合后,荧光强度降低,P＜0.05,而ocu-miR-107序列与XR＿001793654.1片段的突变型共转染后,荧光强度未见显著变化。双荧光素酶报告基因检测证实,XR＿001793654.1可以与ocu-miR-107序列结合,两者间存在相互作用。2、对RAP兔房颤模型进行ocu-miR-107过表达和沉默腺相关病毒的左心房感染实验。并用第二部分模型兔相同刺激频率进行电刺激4周后取材。q RT-PCR检测和荧光显微镜检测感染效率,结果显示术后4周可在左心耳内发现荧光信号,提示感染成功。与inhibitor NC组相比,miR-107-3p inhibitor组中miR-107-3p表达显著下调,P＜0.01,与mimics NC组相比,miR-107-3p mimics组中miR-107-3p表达显著上调,P＜0.01。说明过表达腺相关病毒和沉默腺相关病毒转染成功。Masson染色结果显示,miR-107-3p inhibitor组中纤维化减轻,miR-107-3p mimics组纤维化程度加重。彩色多普勒超声结果显示,刺激4周后,与miR-107-3p mimics组相比,miR-107-3p inhibitor组的LAD、LAVmax、LAVmin等指标显著降低,LAEF显著升高（P＜0.05）;这与第二部分XR＿001793654.1过表达组结果相近。由此结果说明,miR-107-3p的沉默同样可以减轻RAP术后模型兔左心房纤维化程度,改善左心房功能。3、根据数据库资料、生物学信息分析和序列对比后发现ocu-miR-107与KLF13的3’UTR存在结合位点,提示KLF13可能是ocu-miR-107作用的靶基因。双荧光素酶报告基因检测结果显示:与阴性对照组相比,ocu-miR-107序列与KLF13的3’UTR片段野生型结合后,荧光强度降低,P＜0.05,而ocu-miR-107序列与KLF13的3’UTR片段的突变型共转染后,荧光强度未见显著变化。双荧光素酶报告基因检测证实,KLF13的3’UTR可以与ocu-miR-107序列结合,两者间存在相互作用,KLF13应是ocu-miR-107的靶基因。提取miR-107-3p腺相关病毒感染后的RAP兔模型心房组织中的蛋白质进行Western blotting测定,结果显示与miR-107-3p mimics组中KLF13的表达下调,miR-107-3p inhibitor组中KLF13的表达上调,通过IHC检测两组中KLF13的表达,结果与Western blotting检测结果一致。说明miR-107-3p通过调控KLF13的表达在房颤纤维化中发挥作用。我们对AAV-XR＿001793654.1组中心房组织行蛋白水平测定,结果表明AAV-XR＿001793654.1组中KLF13基因表达水平较AAV-NC组中上调,IHC结果与Western blot检测结果一致。同样,我们在房颤患者左心房组织中行蛋白水平测定,结果表明与非房颤组相比,房颤组患者左心耳中KLF13表达水平下调。此结果证实了XR＿001793654.1的低表达可以影响基因KLF13的表达,进而可能促进房颤心房纤维化的发生。4、Western blotting结果显示,XR＿001793654.1过表达后出现KLF13表达水平上调;但是共转染后miR-107-3p mimics可以逆转XR＿001793645.1高表达后对KLF13的促进作用;与AAV-NC+mimics-NC组相比,AAV-XR＿001793654.1+miR-107-3p mimics组中KLF13表达水平上调,P＜0.05,但Masson染色显示两者纤维化程度无明显差异,P＞0.05。说明XR＿001793654.1通过竞争性结合miR-107-3p,调控靶基因KLF13表达,进而影响房颤心房纤维化的发生。研究结论:1、RAP兔心房快速起搏诱导房颤的手术,在刺激时间和模式选择适宜的条件下可以诱发出持续48小时以上的AF,选用间隔刺激死亡率低,兔耐受性好,可以成功诱发出房颤和左心房纤维化。2、lncRNA XR＿001793654.1与房颤纤维化密切相关,保守性好,通过在体实验验证了XR＿001793654.1在RAP兔房颤模型中减轻左心房纤维化程度、对左房功能有一定保护作用并降低房颤诱导性。3、XR＿001793654.1可以通过海绵机制竞争性结合miR-107-3p进而调控下游靶基因KLF13的表达,从而在发挥在房颤心房纤维化中的作用。而miR-107-3p能够逆转XR＿001793654.1抑制房颤心房纤维化的功能。