心脏瓣膜病是世界范围内发病率和死亡率的主要原因。与人口老龄化和先天性功能障碍有关。据统计2016年全世界约有40万心脏瓣膜置换术患者,随着人口老龄化,预计2050年心脏瓣膜置换术患者将达到85万。目前对于严重的瓣膜功能障碍,瓣膜置换术是最有效的解决方案。目前全世界每年进行的瓣膜置换手术,大约55%的病例使用机械瓣膜,其余45%选择生物瓣膜。机械瓣多为金属材料制成,术后患者需要终身抗凝,并不适用于高龄等高危患者。生物心脏瓣膜(BHV)包括牛、猪或马的心包、牛颈静脉或猪心脏瓣膜,和机械瓣膜对比,其具有的特点为低血栓形成率,不需要终身抗凝,但普遍存在抗疲劳能力差,易于钙化等缺点。我国现存先天性心脏病患儿约150万,每年新出生近20万,其中复杂先心病占30%左右,约有5-10%的病儿需要重建肺动脉才能获得根治。目前对于肺动脉的重建至今仍缺乏理想的材料和成熟的产品,人工带瓣管道可用于重建肺动脉,挽救患儿生命,提高手术效果。生物组织材料常用的有自体心包、异种心包、异种主动脉瓣等。随着物质生活水平的提高和人口老龄化,瓣膜手术患者的平均年龄有逐渐升高趋势,而经导管主动脉瓣置入术(transcatheter aortic valve implantation,TAVI)已成为治疗心脏瓣膜疾病的一种新的选择,具有不开胸、无需体外循环、微创和恢复快等优点,生物心脏瓣膜的应用越来越广泛。由于介入瓣膜存在长期耐久性欠佳等缺点,目前仅在高龄危重患者应用,其表面性能需要进一步改进。牛心包作为一种心血管外科手术修补用植入材料,经历40多年临床应用的考验,具有比其他人工修补材料更具方便经济、安全可靠、来源广泛等优点。近年来,利用化学改性后的牛心包组织材料制成的生物瓣,以其优异的耐久性表现成为人工生物瓣的主流产品。鉴于我们在新一代改良型无支架猪瓣设计和抗钙化生物心脏瓣膜研究取得的成果,联合研发了新型全生物肺动脉带瓣管道、全生物主动脉瓣膜,现需探索实验方法,拟观察新型牛心包生物材料的防钙化效果、理化性能、组织相容性的研究。建立可行的实验动物模型,并验证应用新型全生物管道及全生物瓣膜在实验动物体内行置入后的安全性和有效性,为进一步临床应用提供依据。研究目的:新型全生物牛心包材料,经过胰蛋白酶、去垢剂和改变渗透压去细胞处理、戊二醛(Glutaradehyde GA)交联鞣制及2.3丁二醇(butanediol BD)抗钙化改性处理后,经仿生外形结构设计,全牛心包覆膜,采用柔弹性瓣架,通过肺动脉瓣、主动脉瓣在羊体内的植入,观察其有效性及安全性。1.经去细胞处理、戊二醛交联鞣制及丁二醇抗钙化改性后生物材料的实验研究。2.新型全生物肺动脉带瓣管道的大动物试验。3.新型全生物主动脉瓣的大动物试验。研究方法:1.牛心包经过胰蛋白酶、去垢剂和改变渗透压去细胞处理,分别对GA处理、GA+BD联合处理及未经处理的去细胞牛心包材料行分组测定茚三酮实验,胶原酶消化实验,血浆蛋白吸附实验以及血小板黏附实验,以分别探讨新型生物材料的胶原交联度及血液相容性的影响。分别测定牛心包生物材料的急性全身中毒实验、亚急性毒性试验、遗传毒性试验、力学性能测定,观察新型牛心包生物材料的理化性能。将牛心包生物材料植入大鼠体内包埋8周天后取出行HE染色及茜素红染色,观察生物材料钙化程度。2.新型全生物肺动脉带瓣管道,经去细胞处理、GA交联鞣制及BD抗钙化改性处理后的牛心包,通过仿生结构设计,由近心端管道和远心端管道组成,近心端管道采用带有三叶瓣膜用聚酯缝线缝合而成。本试验拟在体外循环辅助心脏不停跳下对羊行肺动脉瓣置换术,植入14例带瓣管道,术后1、3、7、30、90、180天作为观察期。观察植入后动物的血流动力学性能(血流速度、返流面积、跨瓣压差)变化、超声评估结构变化(瓣膜启、闭是否良好);观察植入后有无不良事件(动物的死亡、感染、行为异常情况);植入物周围的炎症反应:周围组织有无粘连、感染、坏死;白细胞、淋巴、细胞、中性粒细胞等数量;人工生物管道及周围组织的病理改变;血栓形成:探查带瓣管道及主要脏器是否有血栓形成;溶血反应:观察红细胞形态、血红蛋白数量变化等;器官病变:心脏、肺、肝、肾、脾等形态学变化;瓣叶及管道的钙化情况及钙含量测定。评价新型全生物肺动脉带瓣管道的安全性和有效性。3.新型全生物主动脉瓣,经去细胞处理、GA交联鞣制及BD抗钙化改性处理后的牛心包,采用柔弹性瓣架,再经仿生结构设计与缝制工艺制造而成。本试验拟在体外循环辅助下对羊行主动脉瓣置换术,植入全生物主动脉瓣10例,1例对照组采用生物心脏瓣膜(美国,爱德华)。术后1、3、7、30、90、180天作为观察期。试验终点观察指标:评价观察植入后的有效性:植入后的血流动力学性能(血流速度、返流面积、跨瓣压差);植入后的结构变化(瓣膜启、闭是否良好)。评价植入后的安全性:不良事件:所有动物的死亡、感染、行为异常情况;植入物周围的炎症反应:人工生物瓣膜和周围组织有无粘连、感染、坏死;白细胞、淋巴、细胞、中性粒细胞等数量;人工生物瓣膜及周围组织的病理改变;血栓形成:观察凝血变化,探查瓣膜及主要脏器是否有血栓形成;溶血反应:观察红细胞形态、血红蛋白数量变化等;器官病变:心脏、肺、肝、肾、脾等形态学变化;瓣环及瓣叶的钙化情况及钙含量测定。评价新型全生物主动脉瓣的安全性和有效性。结果:1.牛心包经过去细胞处理、GA交联鞣制、BD抗钙化改性处理后,急性全身中毒实验、亚急性毒性试验、遗传毒性试验未见明显异常。力学性能测定显示:GA+BD组牛心包断裂伸长率、抗拉负荷较GA组增大,抗拉负荷无明显差异。GA+BD组较未处理组茚三酮值均明显下降,较单用GA处理组茚三酮值进一步下降。牛心包经GA处理后,未消化率较对照组明显增加,GA+BD处理后,未消化率进一步增加,其抗消化能力也进一步增强。GA组蛋白质吸附率较对照组明显升高,再经BD处理后低于对照组。GA处理组血小板黏附率可明显下降,GA+BC组血小板黏附率较对照组低,但两者无显著差异。包埋实验结果显示,新型生物材料未见明显钙化灶,而对照组材料组织钙化明显。2.实验共完成14例全生物肺动脉带瓣管道的羊肺动脉原位植入实验,无意外死亡和严重并发症。其中12例按照计划处死终止实验,2例仍健康存活。植入后瓣膜开启关闭良好,实验全程未出现严重狭窄和关闭不全。经胸超声心动图及血流动力学测定术后存活绵羊肺动脉瓣返流百分比、返流量、中心静脉压、平均主动脉压等指标与术前测量值差异均无统计学意义。和术前对比,植入后肺动脉瓣跨压差未见明显变化。除2例瓣叶钙含量升高,其余所有瓣叶、血管组织钙含量均小于10μg/mg。尸体解剖中各脏器均未发现明显的血栓形成和血栓栓塞。随访过程中实验室检查和尸体解剖未发现明显血细胞破坏、肝肾功损伤、炎症反应等不良事件。组织病理检查未见明显异常。3.实验共完成9例全生物主动脉瓣、1例对照生物主动脉瓣原位植入实验。所有动物均按照实验方案进行了手术植入、术后喂养和数据采集。1只实验组动物在第167天意外死亡。对照组第172天意外死亡。其余动物正常存活至预期时间,按计划进行处死、采集数据和尸体解剖。植入后瓣膜开启关闭良好,实验全程未出现严重狭窄和关闭不全,最大跨瓣压差44.1mmHg,跨瓣压差平均为23.8mmHg。最大反流面积2.4cm~2,平均为1.12±0.53cm~2,未发现瓣周漏或其他异常。和术前相比,术后与实验终点左心室收缩压、左室舒张末压、有效瓣口面积、血流速度无明显差异。实验动物植入的人工全生物心脏瓣膜瓣叶平均钙含量为2.01±1.02μg/mg,对照组瓣叶钙含量2.20μg/mg。实验动物植入的人工全生物心脏瓣膜瓣环平均钙含量为2.53±1.75μg/mg,实验组中1例瓣环钙含量最高为43.57μg/mg,对照组瓣环钙含量71.20μg/mg。尸体解剖中各脏器均未发现明显的血栓形成和血栓栓塞。随访过程中实验室检查和尸体解剖未发现明显血细胞破坏、肝肾功损伤、炎症反应等不良事件。结论:1.本实验应用胰蛋白酶、去垢剂和改变渗透压去细胞处理、GA交联鞣制及BD抗钙化改性处理后的牛心包,通过测定牛心包生物材料的急性全身中毒实验、亚急性毒性试验、遗传毒性试验未见明显毒性反应,力学性能测定良好。通过茚三酮实验,胶原酶消化实验分析,牛心包生物材料的胶原交联度提高。而血浆蛋白吸附实验和血小板黏附实验则验证了处理能够提高牛心包生物材料的血液相容性。通过观察大鼠包埋后的HE染色及茜素红染色,能够有效降低牛心包生物材料的钙化程度。经GA及BD处理能够进一步改善牛心包材料的理化性质,有利于提高血液相容性和减缓钙化,同时对于GA及BD处理方法在进一步研究中的应用提供了重要的理论依据。2.本实验建立了体外循环辅助下不停跳的肺动脉置换的绵羊模型和实验方法,可用于新型防钙化肺动脉带瓣管道的实验研究,同时也为研发新型肺动脉瓣介入系统并进行在体实验研究奠定了基础。新型全生物肺动脉带瓣管道植入后未出现明显并发症和不良事件,具有良好的防钙化效果,术后6个月的随访数据说明该新型全生物肺动脉带瓣管道的动物植入手术是安全的,满足医疗器械植入的安全性和有效性的要求,远期的植入后效果还需进一步观察。3.本实验建立了体外循环下的主动脉瓣置换的绵羊模型和实验方法,可用于新型防钙化瓣膜的实验研究,同时也为研发新型TAVI的介入瓣膜系统并进行在体实验研究奠定了基础。新型全生物主动脉瓣植入后未出现明显并发症和不良事件,1例实验组意外死亡(考虑出血)。实验动物尸检研究均未发现各脏器明显的血栓形成和血栓栓塞,结果表明该产品在常规抗凝强度下有良好的血液相容性。实验结果表明除个别出现局灶钙化,该产品具有良好的防钙化效果。术后6个月的随访数据说明该新型全生物主动脉瓣的动物植入手术是安全的,满足医疗器械植入的安全性和有效性的要求,远期的植入后效果还需进一步观察。